اخبار

استراتژی‌های تشخیصی سنتی برای تشخیص بیماری‌های عفونی نیازمند استفاده از ابزارهای رومیزی است که برای آزمایش نقطه‌ای مراقبت (POCT) مناسب نیستند.میکروسیال‌های نوظهور یک فناوری بسیار کوچک، خودکار و یکپارچه است که یک جایگزین بالقوه برای روش‌های سنتی برای تشخیص سریع، کم هزینه و دقیق در محل است.روش های تشخیص مولکولی به طور گسترده در دستگاه های میکروسیال به عنوان موثرترین روش برای تشخیص پاتوژن استفاده می شود.این بررسی پیشرفت‌های اخیر در تشخیص مولکولی بیماری‌های عفونی مبتنی بر میکروسیال را از دیدگاه دانشگاهی و صنعتی خلاصه می‌کند.ابتدا، ما یک پردازش معمولی روی تراشه اسیدهای نوکلئیک، از جمله پیش تصفیه نمونه، تقویت، و خواندن سیگنال را توصیف می کنیم.سپس ویژگی ها، مزایا و معایب چهار نوع پلت فرم میکروسیال مقایسه می شود.در مرحله بعد، ما در مورد استفاده از سنجش دیجیتال برای کمی سازی مطلق اسیدهای نوکلئیک بحث خواهیم کرد.دستگاه های تشخیصی مولکولی مبتنی بر میکروسیال تجاری کلاسیک و اخیر به عنوان شواهدی از وضعیت فعلی بازار خلاصه می شوند.در نهایت، ما دستورالعمل‌های آینده را برای تشخیص میکروسیالی بیماری‌های عفونی پیشنهاد می‌کنیم.
بیماری های عفونی توسط عوامل بیماری زا از جمله باکتری ها، ویروس ها و انگل ها ایجاد می شوند که در سراسر جهان پراکنده شده اند.بر خلاف سایر بیماری ها، پاتوژن ها به سرعت از طریق تلقیح، هوا و محیط های آبی بین انسان و حیوانات میزبان پخش می شوند [1].پیشگیری از بیماری های عفونی به عنوان یک اقدام بهداشت عمومی حیاتی است.سه استراتژی اصلی برای مبارزه با بیماری های عفونی: (1) کنترل منبع عفونت.(2) وقفه در مسیر انتقال؛(3) حفاظت از جمعیت های حساس.در بین راهبردهای اصلی، کنترل منبع عفونت به دلیل راحتی و هزینه کم، مهمترین استراتژی محسوب می شود.تشخيص سريع، جداسازي و درمان افراد آلوده حياتي است و به راهبردهاي تشخيصي سريع، حساس و دقيق نياز دارد [2].تشخیص فعلی بیماری‌های عفونی معمولاً معاینه بالینی بر اساس علائم و نشانه‌ها و مطالعات آزمایشگاهی مانند کشت سلولی و تشخیص مولکولی را ترکیب می‌کند که به پرسنل آموزش‌دیده، روش‌های فشرده کار، و تجهیزات تست گران قیمت نیاز دارد [3، 4].پیشگیری از شیوع بیماری های عفونی مستلزم تشخیص سریع، ارزان و دقیق محلی است، به ویژه در مناطق با منابع محدود که بیماری های عفونی شایع و شدید هستند [5]، و همچنین درمان در بیابان یا در میدان جنگ، که در آن شرایط اضطراری غیرقابل پیش بینی هستند..مراقبت های پزشکی محدود است [6].در این زمینه، میکروسیالات فناوری‌ای است که فناوری‌های سیستم‌های میکروالکترومکانیکی، نانوتکنولوژی یا علم مواد را برای دستکاری دقیق سیال ترکیب می‌کند [7،8،9،10]، و امکانات جدیدی را برای تشخیص نقطه مراقبت (POCT) ارائه می‌کند.) عوامل عفونی خارج از بیمارستان ها و آزمایشگاه ها.در مقایسه با تشخیص‌های سنتی وقت‌گیر، فناوری میکروسیال صرفه‌جویی در نمونه و هزینه را برای تشخیص مولکولی در طول شیوع بیماری ارائه می‌دهد.گسترش جهانی بیماری کروناویروس 2019 (COVID-19) ناشی از سندرم حاد تنفسی شدید کروناویروس 2 (SARS-CoV-2) است، بنابراین اهمیت میکروسیالات برای پیشگیری و کنترل به موقع همه‌گیری مجدداً مورد تأکید قرار می‌گیرد [11، 12] ، 13].برخلاف تشخیص سنتی، POCT میکروسیالی از دستگاه‌های قابل حمل کوچکی از آنالایزرهای رومیزی گرفته تا نوارهای آزمایشی کوچک کناری برای آزمایش در نزدیکی نقطه نمونه‌برداری استفاده می‌کند [14].این تست‌ها شامل آماده‌سازی ساده یا بدون آماده‌سازی نمونه، تقویت سریع سیگنال و خوانش سیگنال حساس است که منجر به مدت زمان کوتاه و نتایج دقیق در عرض چند دقیقه می‌شود.در دسترس بودن و تولید انبوه ابزارهای مراقبت بهداشتی مبتنی بر میکروسیال، کاربردهای تشخیصی مقرون به صرفه و مستقیم آنها را در خارج از بیمارستان، نزدیک بیمار و حتی در خانه گسترش داده است.
در میان راهبردهای موجود برای تشخیص بیماری‌های عفونی، تشخیص مولکولی یکی از حساس‌ترین راهبردها است [15، 16].علاوه بر این، تشخیص مولکولی اغلب به عنوان استاندارد طلایی برای تشخیص مداوم COVID-19 استفاده می‌شود که امکان تشخیص مستقیم مناطق خاص ویروس RNA یا DNA را قبل از شروع پاسخ ایمنی فراهم می‌کند [17، 18].در بررسی فعلی، ما آخرین پیشرفت‌ها را در فرآیندهای تشخیص مولکولی مبتنی بر میکروسیال برای بیماری‌های عفونی، از دیدگاه دانشگاهی تا دیدگاه‌های صنعتی آینده ارائه می‌کنیم (شکل 1).ما با سه مرحله کلیدی در تشخیص اسید نوکلئیک شروع خواهیم کرد: پیش تصفیه نمونه روی تراشه، تقویت اسید نوکلئیک و خواندن سیگنال.سپس انواع مختلف پلت فرم های میکروسیال را با ساختار و عملکرد آنها مقایسه کردیم و ویژگی های منحصر به فرد (نقاط قوت و ضعف) را نشان دادیم.تشخیص دیجیتال اسید نوکلئیک بیشتر مورد بحث قرار می گیرد و به عنوان نمونه ای از فناوری نسل سوم برای تعیین کمیت مطلق مولکول های پاتوژن عفونی ارائه می شود.علاوه بر این، چندین دستگاه معمولی و جدید تجاری POCT برای نشان دادن وضعیت فعلی بازار POCT میکروسیال برای تشخیص مولکولی ارائه خواهد شد.ما همچنین دیدگاه خود را برای برنامه های آینده مورد بحث و توضیح قرار خواهیم داد.
ماژول‌های تراشه‌های میکروسیال برای تشخیص اسید نوکلئیک را می‌توان با توجه به عملکردشان به سه دسته (نمونه‌گیری، تشخیص و سیگنال‌دهی) تقسیم کرد [19].در میان این ماژول‌ها، ماژول نمونه‌برداری عمدتاً لیز نمونه و استخراج اسید نوکلئیک را انجام می‌دهد.ماژول حسگر عمدتاً تبدیل و تقویت سیگنال های اسید نوکلئیک را کنترل می کند.ماژول سیگنالینگ سیگنال تبدیل شده و پردازش شده توسط ماژول حسگر را تشخیص می دهد.بر اساس فرآیند تشخیص اسیدهای نوکلئیک روی یک تراشه، تراشه های مختلفی را که می توانند عملکرد "ورودی و خروجی" را تحقق بخشند، خلاصه می کنیم.
اولین مرحله در تشخیص اسید نوکلئیک استخراج اسید نوکلئیک است، یعنی جداسازی اسید نوکلئیک هدف از نمونه اصلی.استخراج اسید نوکلئیک برای خالص سازی اسیدهای نوکلئیک از سایر آلاینده های مولکولی، اطمینان از یکپارچگی ساختار اولیه مولکول های اسید نوکلئیک و بهینه سازی نتایج انجام می شود.استخراج اسید نوکلئیک نیاز به لیز نمونه لازم و گرفتن اسید نوکلئیک دارد که کیفیت و کارایی آن تاثیر زیادی در تحقیقات و نتایج تشخیصی دارد.هر گونه عوارض جانبی ظریف در طول استخراج ممکن است تشخیص بیشتر را محدود کند.برای مثال، روش‌های واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) و تقویت همدما حلقه (LAMP) توسط برخی از حلال‌های آلی باقی‌مانده مانند اتانول و ایزوپروپانول در معرف‌های جداسازی اسید نوکلئیک مهار می‌شوند [20].استخراج مایع-مایع و استخراج فاز جامد محبوب ترین روش ها برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک هستند [21]، با این حال، استخراج مایع-مایع بر روی تراشه بسیار محدود است، زیرا معرف های مورد استفاده در استخراج مایع-مایع باعث خوردگی بیشتر تراشه های میکروسیال می شوند. .در اینجا، روش‌های استخراج فاز جامد مبتنی بر ریزآرایه را برجسته می‌کنیم و مزایا و معایب آنها را با هم مقایسه می‌کنیم.
سیلیکون یک ماده بستر سازگار با اسیدهای نوکلئیک به دلیل زیست سازگاری، پایداری و سهولت اصلاح است [22].نکته مهم این است که وقتی با سیلیس یا مواد دیگر اصلاح می شود، این کامپوزیت خواص جذب نوکلئیک اسیدهای با بار منفی را در شرایط pH کم و نمک بالا در حالی که با محلول های نمک کم و pH بالا شستشو می دهد، از خود نشان می دهد.بر اساس این پدیده، می توان اسید نوکلئیک را خالص کرد.
اشکال مختلفی از مواد مبتنی بر سیلیس برای استخراج اسید نوکلئیک در میکروسیال ها استفاده شده است، مانند دانه های سیلیکا، پودرها، فیلترهای میکروفیبر و غشاهای سیلیس [23، 24، 25، 26].بسته به خواص مواد، مواد مبتنی بر سیلیکون را می توان به روش های مختلف در ریز مدارها استفاده کرد.برای مثال، گرانول‌های سیلیکا، پودرها و نانوفیلترهای تجاری را می‌توان به سادگی در منافذ یا ریز کانال‌های تراشه‌های میکروسیال قرار داد و به استخراج اسیدهای نوکلئیک از نمونه‌ها کمک کرد [27، 28، 29].غشاهای سیلیکا اصلاح شده سطحی نیز می توانند برای خالص سازی سریع DNA از پاتوژن ها با هزینه کم استفاده شوند.به عنوان مثال، وانگ و همکاران.[30] با ترکیب واکنش‌های تقویت دناتوره با تبادل زنجیره‌ای با واسطه وزیکول با غشاهای سیلیکا پوشیده شده با الیگوساکاریدهای کیتوزان، یک سیستم قابل حمل همه کاره معرفی شد که با موفقیت 102-108 واحد تشکیل دهنده کلنی را شناسایی کرد.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus.و وجود ویروس به راحتی قابل مشاهده بود.پاول و همکاران[31] سپس از ریزآرایه‌های مبتنی بر سیلیکون برای شناسایی ویروس هپاتیت C (HCV)، ویروس نقص ایمنی انسانی (HIV)، ویروس زیکا و ویروس پاپیلومای انسانی و انتشار خودکار استفاده شد که در آن یک میکروراکتور پیچ‌دار 1.3 میکرولیتری برای گرفتن ویروس‌های RNA ساخته شد.و تقویت درجا انجام دهید.علاوه بر این روش‌ها، ریزستون‌های سیلیسی اصلاح‌شده با سطح نیز نقش کلیدی در استخراج اسید نوکلئیک دارند، زیرا هندسه و خواص مواد اصلاح‌کننده راندمان استخراج را تا حد زیادی افزایش می‌دهد.چن و همکاران[32] یک پلت فرم میکروسیال برای جداسازی RNA با غلظت پایین بر اساس ریزستون های سیلیکونی با پوشش آمینو پیشنهاد کرد.این دستگاه میکروسیال آرایه ای از میکروستون های 0.25 سانتی متر مربع را روی یک بستر سیلیکونی ادغام می کند تا از طریق طراحی نسبت سطح به حجم بالا، راندمان استخراج بالاتری را به دست آورد.مزیت این طراحی این است که دستگاه میکروسیال می تواند تا 95 درصد راندمان استخراج اسید نوکلئیک را به دست آورد.این استراتژی های مبتنی بر سیلیکون ارزش جداسازی سریع اسیدهای نوکلئیک را با هزینه کم نشان می دهد.در ترکیب با تراشه‌های میکروسیال، استراتژی‌های استخراج مبتنی بر سیلیکون نه تنها می‌توانند کارایی تشخیص اسید نوکلئیک را افزایش دهند، بلکه کوچک‌سازی و ادغام دستگاه‌های تحلیلی را تسهیل می‌کنند [20].
روش‌های جداسازی مغناطیسی از ذرات مغناطیسی برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک در حضور میدان مغناطیسی خارجی استفاده می‌کنند.ذرات مغناطیسی رایج شامل ذرات مغناطیسی Fe3O4 یا γ-Fe2O3 هستند که با سیلیس، آمینو و کربوکسیل پوشش داده شده اند [33،34،35،36].ویژگی متمایز ذرات مغناطیسی در مقایسه با روش های SPE مبتنی بر سیلیکون، سهولت دستکاری و کنترل با آهنرباهای خارجی است.
با استفاده از برهمکنش الکترواستاتیکی بین اسیدهای نوکلئیک و سیلیس، در شرایط نمک زیاد و PH پایین، اسیدهای نوکلئیک بر روی سطح ذرات مغناطیسی پوشش داده شده با سیلیس جذب می شوند، در حالی که در شرایط نمک کم و pH بالا، می توان مولکول ها را شستشو داد. از نو..دانه های مغناطیسی پوشش داده شده با سیلیس استخراج DNA از نمونه های حجمی بزرگ (400 میکرولیتر) را با استفاده از حرکت کنترل شده مغناطیسی ممکن می سازد [37].به عنوان یک نمایش، رودریگز-ماتئوس و همکاران.[38] از آهنرباهای قابل تنظیم برای کنترل انتقال مهره های مغناطیسی به محفظه های مختلف استفاده کرد.بر اساس ذرات مغناطیسی پوشش داده شده با سیلیس، 470 کپی در میلی لیتر از RNA ژنومی SARS-CoV-2 را می توان از نمونه های فاضلاب برای تشخیص رونویسی معکوس LAMP (RT-LAMP) استخراج کرد و پاسخ را می توان در عرض 1 ساعت خواند.چشم غیر مسلح (شکل 2 الف).
دستگاه های مبتنی بر مواد مغناطیسی و متخلخل.نمودار مفهومی دستگاه میکروسیال IFAST RT-LAMP برای تشخیص RNA SARS-CoV-2 (اقتباس از [38]).b دستگاه میکرو گریز از مرکز برای dSPE نوکلئیک اسید سواب باکال (اقتباس از [39]).c متمرکز کننده نمونه داخلی با استفاده از کارت FTA® (اقتباس از [50]).d کاغذ صافی فیوژن 5 اصلاح شده با کیتوزان (اقتباس از [51]).SARS-CoV-2 سندرم حاد تنفسی شدید کروناویروس 2، تقویت همدما با واسطه حلقه رونویسی معکوس RT-LAMP، شرکای فناوری یاب FTA، اسید نوکلئیک NA
ذرات مغناطیسی با بار مثبت برای اتصال ستون فقرات فسفات اسید نوکلئیک ایده آل هستند.در غلظت خاصی از نمک، گروه های فسفات با بار منفی اسیدهای نوکلئیک می توانند بر روی سطح ذرات کامپوزیت مغناطیسی بار مثبت داشته باشند.بنابراین، نانوذرات مغناطیسی با سطح ناهموار و چگالی بالا از گروه‌های آمینه برای استخراج اسیدهای نوکلئیک ساخته شدند.پس از جداسازی و انسداد مغناطیسی، نانوذرات مغناطیسی و کمپلکس‌های DNA را می‌توان مستقیماً در PCR استفاده کرد که نیاز به عملیات تصفیه و شستشوی پیچیده و زمان‌بر را از بین می‌برد [35].نانوذرات مغناطیسی پوشش داده شده با گروه های کربوکسیل منفی نیز برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک جذب شده بر روی سطوح در محلول های پلی اتیلن گلیکول و کلرید سدیم با غلظت بالا استفاده شده است [36].با این دانه‌های مغناطیسی اصلاح‌شده با سطح، استخراج DNA با تقویت بعدی سازگار است.دیگنان و همکاران[39] یک پلت فرم میکروسیال گریز از مرکز خودکار و قابل حمل را برای پیش تصفیه اسید نوکلئیک توصیف کرد که به پرسنل غیر فنی اجازه می دهد از آن در محل استفاده کنند.علاوه بر این، سازگاری DNA جدا شده با LAMP، روشی مناسب برای تجزیه و تحلیل اسید نوکلئیک در نقطه مراقبت، حداقل نیاز تجهیزات و مناسب بودن برای سنجش رنگ سنجی را بیشتر نشان می دهد (شکل 2b).
روش‌های مهره‌های مغناطیسی امکان استخراج خودکار را ارائه می‌دهند، که برخی از آنها در استخراج‌کننده‌های اسید نوکلئیک خودکار تجاری وجود دارد [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (پکن، چین) و Biomek®.بکمن (میامی، ایالات متحده آمریکا).)، فلوریدا، ایالات متحده آمریکا)].از مزایای ترکیب دانه های مغناطیسی با میکروسیال ها می توان برای استخراج خودکار کارآمد اسیدهای نوکلئیک استفاده کرد که به طور بالقوه می تواند توسعه تشخیص مولکولی را پیش ببرد.با این حال، ترکیب مهره‌های مغناطیسی با میکروسیال‌ها هنوز هم به شدت به سیستم‌های کنترل پیچیده برای دستکاری دقیق مهره‌های مغناطیسی وابسته است، که محبوبیت محصولات تجاری حجیم و گران قیمت را توضیح می‌دهد، که کاربرد بیشتر دانه‌های مغناطیسی در POCT را محدود می‌کند.
چندین ماده متخلخل مانند فیلترهای نیتروسلولوز اصلاح شده، کارت های Finders Technology Associates (FTA)، کاغذهای فیلتر مبتنی بر پلی اتر سولفون، و مواد پوشش داده شده با گلیکان نیز برای تشخیص اسید نوکلئیک استفاده شده اند [40، 41، 42، 43، 44].مواد فیبری متخلخل مانند کاغذ فیبری ابتدا برای جداسازی DNA با درهم تنیدگی فیزیکی مولکول های DNA رشته بلند با الیاف استفاده شد.منافذ کوچک منجر به محدودیت فیزیکی قوی مولکول‌های DNA می‌شوند که بر استخراج DNA تأثیر مثبت می‌گذارد.با توجه به اندازه منافذ مختلف کاغذ فیبری، راندمان استخراج نمی تواند نیازهای تقویت DNA را برآورده کند [45، 46].کارت FTA یک کاغذ صافی تجاری است که در زمینه پزشکی قانونی استفاده می شود و به طور گسترده در سایر زمینه های تشخیص مولکولی استفاده می شود.از طریق استفاده از کاغذ صافی سلولزی آغشته به مواد شیمیایی مختلف برای لیز غشاهای سلولی در نمونه، DNA آزاد شده تا 2 سال از تخریب محافظت می شود.اخیراً، کاغذ سلولز آغشته شده برای تشخیص مولکولی پاتوژن‌های مختلف از جمله SARS-CoV-2، لیشمانیوز و مالاریا ساخته شده است [47،48،49].HIV در پلاسمای جدا شده مستقیماً لیز می شود و اسید نوکلئیک ویروسی در غشای جریان FTA® ساخته شده در متمرکز کننده غنی می شود که امکان تولید موثر اسید نوکلئیک [50] را فراهم می کند (شکل 2c).مشکل اصلی تشخیص نوکلئیک اسید با استفاده از کارت های FTA این است که مواد شیمیایی مانند گوانیدین و ایزوپروپانول واکنش های تقویت بعدی را مهار می کنند.برای حل این مشکل، ما کاغذ صافی اصلاح شده با کیتوزان Fusion 5 را توسعه دادیم که مزایای هر دو ترکیب فیزیکی مولکول های DNA و کاغذ صافی فیبری و جذب الکترواستاتیکی DNA روی ترکیبات اصلاح شده با کیتوزان را برای دستیابی به استخراج بسیار کارآمد اسید نوکلئیک ترکیب می کند. ..الیاف فیلتر [51] (شکل 2d).به طور مشابه، ژو و همکاران.[52] یک روش PCR اصلاح شده با کیتوزان را بر اساس یک سیستم میکروسیال مویرگی درجا برای جداسازی و تشخیص سریع RNA ویروس زیکا نشان داد.اسیدهای نوکلئیک را می توان به ترتیب در یک محیط مخلوط لیزات/PCR بر اساس ویژگی کلید روشن/خاموش کیتوزان جذب/واجذب کرد.روشن و خاموش»، به pH پاسخ می دهد.
همانطور که در بالا ذکر شد، این استراتژی ها مزایای مواد مختلف فاز جامد را با هم ترکیب کرده و کارایی استخراج اسید نوکلئیک را در میکروسیال ها افزایش می دهد.در کاربردهای عملی، استفاده از این مواد در مقادیر زیاد غیراقتصادی است و عملیات سطحی مناسب یا اصلاح سطحی مواد رایج با این مواد نیز می تواند عملکرد آنها را حفظ کند.بنابراین اعتقاد بر این است که اجرای این استراتژی ها پس از مطالعه آزمایشی می تواند هزینه ها را کاهش دهد.
آزمایش اسید نوکلئیک روی پلتفرم‌های میکروسیال اغلب از حجم‌های نمونه کوچک (کمتر از 100 میکرولیتر) استفاده می‌کند، بنابراین نیاز به تقویت اسیدهای نوکلئیک هدف با پروب‌های خاص برای تبدیل به سیگنالی مناسب برای تشخیص پایین‌دست (نوری، الکتریکی و مغناطیسی) دارد [53, 54]. آزمایش اسید نوکلئیک روی پلتفرم‌های میکروسیال اغلب از حجم‌های نمونه کوچک (کمتر از 100 میکرولیتر) استفاده می‌کند، بنابراین نیاز به تقویت اسیدهای نوکلئیک هدف با پروب‌های خاص برای تبدیل به سیگنالی مناسب برای تشخیص پایین‌دست (نوری، الکتریکی و مغناطیسی) دارد [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. هنگام آزمایش اسیدهای نوکلئیک بر روی پلت فرم های میکروسیال، حجم نمونه کوچک (<100 میکرولیتر) اغلب مورد استفاده قرار می گیرد، بنابراین تقویت اسیدهای نوکلئیک هدف با پروب های ویژه برای تبدیل آن به سیگنال مناسب برای تشخیص بعدی (نوری، الکتریکی و مغناطیسی) مورد نیاز است. [53، 54].微流控平台上的核酸检测通常使用小样本量（< 100 µl），因此需要使用特定探针扩增目标核酸，以转换为便于下游检测（光学、电学和磁学）的信号[53, 54 ].微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. تشخیص اسیدهای نوکلئیک بر روی پلتفرم های میکروسیال معمولاً از حجم نمونه کوچک (<100 میکرولیتر) استفاده می کند که نیاز به تقویت اسیدهای نوکلئیک هدف با پروب های ویژه دارد تا آنها را به سیگنال هایی برای تشخیص بعدی (نوری، الکتریکی و مغناطیسی) تبدیل کند [53، 54]. .تقویت اسید نوکلئیک در میکروسیال ها همچنین می تواند واکنش ها را سرعت بخشد، محدودیت های تشخیص را بهینه کند، نیاز به نمونه را کاهش دهد و دقت تشخیص را بهبود بخشد [55، 56].در سال‌های اخیر با تحقق تشخیص سریع و دقیق، روش‌های مختلف تقویت اسید نوکلئیک در میکروسیال‌ها از جمله PCR و برخی واکنش‌های تقویت همدما به کار گرفته شده است.در این بخش روش‌های تشخیص نوکلئیک اسید بر اساس سیستم‌های میکروسیال خلاصه می‌شود.
PCR شبیه سازی فرآیند تکثیر DNA یک موجود است که تئوری آن در جای دیگری به تفصیل توضیح داده شده است و در اینجا مورد بحث قرار نخواهد گرفت.PCR می تواند مقدار بسیار کمی از DNA/RNA هدف را با سرعت نمایی تقویت کند و PCR را به ابزاری قدرتمند برای تشخیص سریع اسیدهای نوکلئیک تبدیل کند.در دهه‌های اخیر، بسیاری از دستگاه‌های میکروسیال قابل حمل مجهز به سیستم‌های چرخه حرارتی PCR برای رفع نیازهای تشخیص نقطه‌ای توسعه یافته‌اند [57، 58].PCR روی تراشه را می توان با توجه به روش های مختلف کنترل دما به چهار نوع (معمولی، جریان پیوسته، PCR فضایی سوئیچ شده و همرفتی) تقسیم کرد [59].به عنوان مثال، Gee et al.[60] یک روش PCR کمی رونویسی معکوس مستقیم (RT-qPCR) را بر روی پلت فرم میکروسیالی خود برای تشخیص چندگانه SARS-CoV-2، آنفلوانزای A و B در نمونه‌های سواب گلو توسعه دادند (شکل 3a).پارک و همکاران[61] یک تراشه تجزیه و تحلیل پاتوژن ساده را با ادغام PCR لایه نازک، الکترودها و یک ماژول میکروسیال مبتنی بر پلی دی متیل سیلوکسان با انگشت ساخت.با این حال، هر دو کار شامل کاستی های رایج PCR معمولی است.PCR به چرخه حرارتی نیاز دارد که کوچک سازی بیشتر دستگاه و کاهش زمان تست را محدود می کند.
توسعه PCR میکروسیال و سوئیچ فضایی مبتنی بر جریان پیوسته برای پرداختن به این موضوع حیاتی است.با استفاده از یک کانال مارپیچ بلند یا یک کانال مستقیم کوتاه، PCR جریان پیوسته می‌تواند تقویت سریعی را با گردش فعال معرف‌ها در سه ناحیه پیش‌گرم با یک پمپ خارج از تراشه فراهم کند.این عملیات به طور موفقیت آمیزی از فاز انتقال بین دماهای مختلف واکنش اجتناب می کند و بنابراین زمان آزمایش را به طور قابل توجهی کاهش می دهد [62] (شکل 3b).در مطالعه دیگری توسط یونگ و همکاران.[63] یک تحلیلگر ژنتیکی چرخشی PCR پیشنهاد کرد که ویژگی های PCR ثابت و جریان را برای PCR رونویسی معکوس فوق سریع و چندگانه ترکیب می کند (شکل 3c).برای تقویت اسید نوکلئیک، ریزتراشه PCR از طریق سه بلوک حرارتی در دماهای مختلف چرخانده می‌شود: 1. بلوک دناتوره‌سازی 94 درجه سانتی‌گراد، 2. بلوک بازپخت در دمای 58 درجه سانتی‌گراد، 3. بلوک انبساط در دمای 72 درجه سانتی‌گراد.
کاربرد PCR در میکروفلوئیدیک.نمایش شماتیک dirRT-qPCR روی یک پلت فرم میکروسیالی (اقتباس از [60]).b نمایش شماتیک یک ریزآرایه PCR جریان پیوسته بر اساس یک کانال سرپانتین (اقتباس از [62]).c نمایش شماتیک یک آنالایزر ژنتیکی چرخشی PCR، متشکل از یک ریزتراشه، سه بلوک حرارتی و یک موتور پله ای (اقتباس از [63]).d نمودار PCR گرما همرفت با سانتریفیوژ و تنظیم (اقتباس از [64]).DirRT-qPCR، واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس کمی مستقیم
با استفاده از مویرگ ها و حلقه ها یا حتی صفحات نازک، PCR همرفتی می تواند به سرعت اسیدهای نوکلئیک را با همرفت حرارتی آزاد طبیعی بدون نیاز به پمپ خارجی تقویت کند.به عنوان مثال، یک پلت فرم میکروسیالی پلیمری الفین حلقوی بر روی یک مرحله گرمایش دوار ساخته شده ایجاد شد که از چرخه حرارتی با سانتریفیوژ در یک میکروکانال حلقه PCR استفاده می کند [64] (شکل 3d).محلول واکنش توسط همرفت حرارتی هدایت می شود که به طور مداوم دمای بالا و پایین را در یک میکروکانال با ساختار حلقوی مبادله می کند.کل فرآیند تقویت را می توان در 10 دقیقه با محدودیت تشخیص 70.5 pg/channel کامل کرد.
همانطور که انتظار می رود، سریع PCR یک ابزار قدرتمند برای سیستم های تشخیص مولکولی و تجزیه و تحلیل مولتی پلکس به طور کامل نمونه-پاسخ است.PCR سریع زمان مورد نیاز برای شناسایی SARS-CoV-2 را به طور قابل توجهی کاهش می دهد، که به کنترل موثر همه گیری COVID-19 کمک می کند.
PCR به یک سیکلر حرارتی پیچیده نیاز دارد که برای POCT مناسب نیست.اخیراً، تکنیک‌های تقویت همدما برای میکروسیال‌ها، از جمله اما نه محدود به LAMP، تقویت پلیمراز رکامبیناز (RPA) و تقویت بر اساس توالی‌های اسید نوکلئیک استفاده شده است [65،66،67،68].با این تکنیک‌ها، اسیدهای نوکلئیک در دمای ثابت تقویت می‌شوند و ایجاد دستگاه‌های POCT قابل حمل کم‌هزینه و بسیار حساس برای تشخیص مولکولی را تسهیل می‌کنند.
سنجش‌های LAMP مبتنی بر میکروفلوئیدیک با کارایی بالا امکان تشخیص چندگانه بیماری‌های عفونی را فراهم می‌کند [42، 69، 70، 71].در ترکیب با یک سیستم میکروسیال گریز از مرکز، LAMP می تواند اتوماسیون تشخیص اسید نوکلئیک را بیشتر تسهیل کند [69، 72، 73، 74، 75].SlipChip چرخش و واکنش برای تشخیص بصری چندین باکتری موازی با استفاده از LAMP [76] توسعه داده شد (شکل 4a).هنگام استفاده از LAMP بهینه شده در سنجش، نسبت سیگنال به نویز فلورسانس تقریباً 5 برابر بود و حد تشخیص به 7.2 کپی / میکرولیتر از DNA ژنومی رسید. علاوه بر این، وجود پنج پاتوژن باکتریایی گوارشی رایج شامل باسیلوس سرئوس، اشرشیاکلی، سالمونلا انتریکا، ویبریو فلوویالیس و ویبریو پاراهمولیتیکوس بر اساس روش در کمتر از 60 دقیقه مشاهده شد. علاوه بر این، وجود پنج پاتوژن باکتریایی گوارشی رایج شامل باسیلوس سرئوس، اشرشیاکلی، سالمونلا انتریکا، ویبریو فلوویالیس و ویبریو پاراهمولیتیکوس بر اساس روش در کمتر از 60 دقیقه مشاهده شد.همچنین حضور پنج پاتوژن باکتریایی رایج دستگاه گوارش شامل باسیلوس سرئوس، اشریشیا کلی، سالمونلا انتریکا، ویبریو فلوویالیس و ویبریو پاراهمولیتیکوس با استفاده از این روش در کمتر از 60 دقیقه مشاهده شد.此外，基于该方法在<60分钟内可视化了五种常见消化道细菌病原体的存在，包括蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、河流弧菌和副溶血性弧菌。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血性。。。 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPعلاوه بر این، حضور پنج پاتوژن باکتریایی رایج گوارشی شامل باسیلوس سرئوس، اشریشیا کلی، سالمونلا انتریکا، ویبریو فلوویوس و ویبریو پارهمولیتیکوس با استفاده از این روش در کمتر از 60 دقیقه مشاهده شد.
از جمله مزایای LAMP در میکروسیالات می توان به پاسخ سریع و تشخیص مینیاتوری اشاره کرد.با این حال، با توجه به دمای واکنش (حدود 70 درجه سانتیگراد)، ذرات معلق در هوا به ناچار در طول LAMP تولید می شوند که منجر به نرخ مثبت کاذب بالا می شود.ویژگی سنجش، طراحی پرایمر و کنترل دما نیز باید برای LAMP بهینه شود.علاوه بر این، طرح‌های تراشه‌ای که تشخیص اهداف چندگانه را روی یک تراشه پیاده‌سازی می‌کنند، ارزش زیادی دارند و باید توسعه یابند.علاوه بر این، LAMP برای تشخیص چند منظوره ادغام شده در یک تراشه مناسب است که از اهمیت بالایی برخوردار است، اما هنوز جای زیادی برای توسعه وجود دارد.
نرخ بالای مثبت کاذب LAMP را می توان تا حدی با RPA کاهش داد، زیرا دمای واکنش نسبتاً پایین (~37 درجه سانتیگراد) منجر به مشکلات تبخیر نسبتا کمی می شود [77].در سیستم RPA، دو آغازگر مخالف سنتز DNA را با اتصال به یک recombinase آغاز می کنند و تکثیر را می توان در عرض 10 دقیقه تکمیل کرد [78،79،80،81].بنابراین، کل فرآیند RPA بسیار سریعتر از PCR یا LAMP است.در سال‌های اخیر، فناوری میکروسیال برای بهبود بیشتر سرعت و دقت RPA نشان داده شده است [82،83،84].به عنوان مثال، لیو و همکاران.[85] یک سنجش تقویتی پلیمراز ریکامبیناز جریان جانبی یکپارچه میکروسیالی را برای تشخیص سریع و حساس SARS-CoV-2 با ادغام RPA رونویسی معکوس (RT-RPA) و یک سیستم تشخیص نوار تست جریان جانبی جهانی توسعه داد.به یک سیستم میکروسیال واحد.شکل 4 ب).حد تشخیص 1 کپی/µl یا 30 کپی/نمونه است و تشخیص را می توان در حدود 30 دقیقه تکمیل کرد.کنگ و همکارانیک دستگاه میکروسیال پوشیدنی ساخته اند.[86] از دمای بدن و یک سیستم تشخیص فلورسانس مبتنی بر تلفن همراه برای شناسایی سریع و مستقیم DNA HIV-1 با استفاده از RPA استفاده کرد (شکل 4c).سنجش RPA پوشیدنی 100 کپی در میلی لیتر از توالی هدف را در عرض 24 دقیقه شناسایی می کند، که پتانسیل بالایی برای تشخیص سریع نوزادان آلوده به HIV-1 در تنظیمات محدود به منابع نشان می دهد.
تقویت ایزوترمال در تست نقطه مراقبت (POCT).توسعه و تولید SlipChip اسپین و واکنش.پس از جوشکاری پلاسما، تراشه های بالا و پایین با مجموعه ای از مهره ها مونتاژ شدند تا تراشه نهایی را تشکیل دهند (اقتباس از [76]).b شماتیک سیستم MI-IF-RPA برای تشخیص COVID-19 (اقتباس از [85]).c شماتیک یک تست RPA پوشیدنی برای تشخیص سریع DNA HIV-1 (اقتباس از [86]).SE Salmonella enterica، VF Vibrio fluvius، VP Vibrio parahaemolyticus، BC Bacillus cereus، EC Escherichia coli، FAM carboxyfluorescein، ویروس نقص ایمنی انسانی HIV، تقویت پلیمراز RPA recombinase، دیود ساطع نور LED، دیود ساطع نور LED، MI-IF-R. تقویت
RPA مبتنی بر میکروسیال به سرعت در حال توسعه است، با این حال، هزینه ساخت تراشه و مصرف واکنش بسیار زیاد است و باید برای افزایش دسترسی به این فناوری کاهش یابد.علاوه بر این، حساسیت بالای RPA می تواند بر تقویت محصولات غیر اختصاصی به ویژه در صورت وجود آلودگی تأثیر بگذارد.این محدودیت‌ها ممکن است بر کاربرد RPA در سیستم‌های میکروسیال تأثیر بگذارد و مستحق بهینه‌سازی بیشتر باشد.آغازگرها و پروب‌های خوب طراحی شده برای اهداف مختلف نیز برای بهبود امکان‌سنجی استراتژی‌های میکروسیال مبتنی بر RPA در POCT مورد نیاز است.
Cas13 و Cas12a توانایی جدا کردن تصادفی اسیدهای نوکلئیک را دارند و بنابراین می توانند به عنوان ابزار تشخیص و تشخیص توسعه داده شوند.Cas13 و Cas12a به ترتیب با اتصال به DNA یا RNA هدف فعال می شوند.پس از فعال شدن، پروتئین شروع به جدا کردن دیگر اسیدهای نوکلئیک مجاور می کند، پس از آن RNA های راهنما که اسیدهای نوکلئیک خاص پاتوژن را هدف قرار می دهند، می توانند پروب های فلورسنت خاموش شده را شکافته و فلورسانس آزاد کنند.بر اساس این نظریه، کلنر و همکاران.[87] یک روش مبتنی بر Cas13 را توسعه دادند [باز کردن قفل گزارشگر آنزیمی با حساسیت بالا (SHERLOCK)] و بروتون و همکاران.[88] رویکرد دیگری بر اساس Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)] توسعه داد.
در سال های اخیر، روش های مختلفی برای تشخیص اسیدهای نوکلئیک بر اساس CRISPR ظاهر شده است [89، 90].روش های مرسوم مبتنی بر CRISPR به دلیل چندین روش از جمله استخراج اسید نوکلئیک، تقویت و تشخیص CRISPR اغلب وقت گیر و کار فشرده هستند.قرار گرفتن مایعات در معرض هوا ممکن است احتمال نتایج مثبت کاذب را افزایش دهد.با توجه به موارد فوق، سیستم های مبتنی بر CRISPR نیاز مبرمی به بهینه سازی دارند.
یک پلت فرم میکروسیال با کنترل پنوماتیک که می تواند 24 تحلیل را به صورت موازی انجام دهد برای کاربردهای تشخیص CRISPR-Cas12a و CRISPR-Cas13a توسعه یافته است [91].این سیستم مجهز به یک دستگاه تشخیص فلورسانس است که تقویت اسید نوکلئیک را دور می زند و به طور خودکار نمونه های DNA و RNA فمتومولار را تشخیص می دهد.چن و همکاران[92] تقویت recombinase یکپارچه با سیستم CRISPR-Cas12a در میکروسیالات گریز از مرکز (شکل 5a).این کار بر دشواری ادغام این دو فرآیند غلبه می کند زیرا Cas12a می تواند DNA پیام رسان را هضم کند و روند تقویت را مهار کند.علاوه بر این، چن و همکاران.[92] علاوه بر این، معرف های واکنش را از قبل در یک کنترل میکروسیال گریز از مرکز ذخیره کرد تا به طور خودکار کل فرآیند را تکمیل کند.در اثر دیگری، سیلوا و همکاران.[93] یک روش تشخیصی بدون تقویت CRISPR/Cas12a و یک گوشی هوشمند برای تشخیص SARS-CoV-2 توسعه داد (شکل 5b).این سنجش، که به عنوان یک سیستم بدون تقویت مبتنی بر تلفن همراه شناخته می‌شود، شامل یک آنزیم وابسته به CRISPR/Cas است که مبتنی بر تجسم سیگنال‌های حباب تولید شده توسط کاتالاز در کانال‌های میکروسیال است.تشخیص حساس کمتر از 50 کپی در میکرولیتر اسید نوکلئیک بدون پیش تقویت، کل فرآیند از تزریق نمونه تا خواندن سیگنال تنها 71 دقیقه طول می کشد.
روش های تشخیص اسید نوکلئیک بر اساس CRISPRPOCT گریز از مرکز برای تشخیص مولکولی یکپارچه بر اساس CRISPR (اقتباس از [92]).ب توسعه آزمون CASCADE برای تجزیه و تحلیل مبتنی بر گوشی هوشمند SARS-CoV-2 (اقتباس از [93]).تقویت RAA recombinase، موتیف protospacer مجاور PAM، تکرارهای پالیندرومی کوتاه خوشه ای CRISPR در فواصل منظم، سیستم CASCADE بدون تقویت تلفن همراه با آنزیم های وابسته به CRISPR/CAS، 1-اتیل-3-[3-دی متیل آمینوپروپیل] هیدروکلراید کربودی ایمید EDC
به عنوان آخرین مرحله در تشخیص اسید نوکلئیک، تشخیص سیگنال به طور مستقیم نتایج تشخیصی را منعکس می کند و یک عامل مهم در توسعه یک POCT کارآمد، حساس و دقیق است.سیگنال ها را می توان با استفاده از روش های مختلف مانند راهبردهای فلورسنت، الکتروشیمیایی، رنگ سنجی و مغناطیسی خواند.در این بخش، منطق هر رویکرد را شرح می‌دهیم و تشخیص مولکولی بیماری‌های عفونی را در میکروفلوئیدیک مقایسه می‌کنیم.
استراتژی های مبتنی بر فلورسانس به دلیل مزایای قابل توجه حساسیت عالی، هزینه کم، سهولت کار و تجزیه و تحلیل نقطه مراقبت به طور گسترده برای تشخیص POCT بیماری های عفونی استفاده می شود [94، 95].این استراتژی‌ها از فلوروفورهای برچسب‌دار مانند رنگ‌های فلورسنت و نانومواد برای ایجاد یک سیگنال قابل تشخیص (افزایش فلورسانس یا خاموش کردن) استفاده می‌کنند.این یافته نشان می‌دهد که استراتژی‌های مبتنی بر فلورسانس را می‌توان به برچسب‌گذاری مستقیم فلورسنت، تشخیص فلورسنت سیگنال روشن و سیگنال خاموش تقسیم کرد [96].تشخیص مستقیم برچسب فلورسنت از برچسب‌های فلورسنت ویژه برای برچسب زدن لیگاندهای خاصی استفاده می‌کند که وقتی به طور انتخابی به هدف متصل می‌شوند مقدار خاصی از فلورسانس تولید می‌کنند.برای تشخیص فلورسانس مبتنی بر سیگنال، کیفیت سیگنال فلورسنت به طور مثبت با بزرگی مورد علاقه مرتبط است.شدت فلورسانس در غیاب هدف ناچیز است و زمانی قابل تشخیص است که مقدار کافی هدف وجود داشته باشد.برعکس، شدت فلورسانس شناسایی شده توسط فلورسانس "سیگنال خاموش" با مقدار هدف نسبت معکوس دارد، در ابتدا به حداکثر مقدار می رسد و به تدریج با بزرگ شدن هدف کاهش می یابد.به عنوان مثال، با استفاده از مکانیزم CRISPR-Cas13a وابسته به هدف ترانس برش، Tian et al.[97] یک استراتژی تشخیص جدید برای تشخیص RNAهایی که مستقیماً رونویسی معکوس را دور می زنند، توسعه داد (شکل 6a).پس از اتصال به RNA های هدف مکمل، کمپلکس CRISPR-Cas13-RNA را می توان فعال کرد و باعث ایجاد شکاف بین وثیقه ای توسط RNA های گزارشگر غیر اختصاصی می شود.گزارشگر با برچسب فلورسنتی [فلوروفور (F)] توسط خاموش کننده (Q) دست نخورده خاموش می شود و هنگامی که توسط کمپلکس فعال شده شکافته می شود فلورسانس می شود.
مزیت تشخیص الکتروشیمیایی سرعت تشخیص بالا، تولید آسان، هزینه کم، حمل آسان و کنترل خودکار است.این یک روش تحلیلی قدرتمند برای کاربردهای POCT است.بر اساس ترانزیستورهای اثر میدان گرافن Gao و همکاران.[98] یک نانوبیوسنسور برای تشخیص چندگانه آنتی ژن های بیماری لایم از باکتری Borrelia burgdorferi با حد تشخیص 2 pg/mL ایجاد کرد (شکل 6b).
سنجش رنگ سنجی در کاربردهای POCT استفاده شده است که از مزایای قابل حمل بودن، هزینه کم، سهولت آماده سازی و خواندن بصری بهره می برد.تشخیص رنگ سنجی می تواند از اکسیداسیون پراکسیداز یا نانومواد شبه پراکسیداز، تجمع نانومواد، و افزودن رنگ های شاخص برای تبدیل اطلاعات مربوط به حضور اسیدهای نوکلئیک هدف به تغییرات رنگ قابل مشاهده استفاده کند [99، 100، 101].قابل ذکر است که نانوذرات طلا به طور گسترده در توسعه استراتژی های رنگ سنجی استفاده می شوند و به دلیل توانایی آنها در ایجاد تغییرات رنگی سریع و قابل توجه، علاقه روزافزونی به توسعه پلت فرم های رنگ سنجی POCT برای تشخیص درجا بیماری های عفونی وجود دارد [102].با یک دستگاه میکروسیال گریز از مرکز یکپارچه [103]، پاتوژن های غذایی موجود در نمونه های شیر آلوده را می توان به طور خودکار در سطح 10 سلول باکتری شناسایی کرد و نتایج را می توان به صورت بصری در عرض 65 دقیقه خواند (شکل 6c).
تکنیک‌های سنجش مغناطیسی می‌توانند آنالیت‌ها را با استفاده از مواد مغناطیسی به دقت شناسایی کنند و در دهه‌های اخیر علاقه قابل توجهی به کاربردهای POCT وجود داشته است.تکنیک های سنجش مغناطیسی مزایای منحصر به فردی مانند مواد مغناطیسی کم هزینه به جای قطعات نوری گران قیمت دارند.با این حال، استفاده از میدان مغناطیسی کارایی تشخیص را بهبود می بخشد و زمان آماده سازی نمونه را کاهش می دهد [104].علاوه بر این، نتایج کاوشگر مغناطیسی ویژگی، حساسیت و نسبت سیگنال به نویز بالا را به دلیل سیگنال پس‌زمینه مغناطیسی ناچیز نمونه‌های بیولوژیکی نشان می‌دهد [105].شارما و همکارانیک حسگر زیستی مبتنی بر اتصال تونل مغناطیسی را در یک پلت فرم ریزتراشه قابل حمل ادغام کرد.[106] برای تشخیص چندگانه پاتوژن ها (شکل 6d).حسگرهای زیستی با حساسیت نوکلئیک اسیدهای زیر نانومولار جدا شده از پاتوژن ها را شناسایی می کنند.
روش تشخیص سیگنال معمولیمفهوم تشخیص بیش از حد Cas13a (اقتباس از [97]).b نانوبیوسنسور گرافن FET در ترکیب با Lyme GroES scFv (اقتباس از [98]).c نشانه های رنگ سنجی برای تشخیص چندگانه پاتوژن های مواد غذایی در یک تراشه میکروسیال گریز از مرکز: نمونه های شماره 1 و شماره 3 با پاتوژن های هدف، و نمونه های شماره 2، شماره 4 و 5 بدون پاتوژن های هدف (اقتباس از [103]) .d حسگر زیستی مبتنی بر اتصال تونل مغناطیسی، شامل یک پلت فرم، تقویت کننده مسدودکننده داخلی، یک واحد کنترل، و یک منبع تغذیه برای تولید/اکتساب سیگنال (اقتباس از [106]).GFET گرافن FET، اشریشیا کلی، اشریشیا کلی، سالمونلا تیفی موریوم، ویبریو پارهمولیتیکوس، ویبریو پارهمولیتیکوس، لیستریا مونوسیتوژنز، PC PC، PDMS دایمتیکون، PMMA پلی متیل متاکریلات
علیرغم ویژگی های عالی روش های تشخیص فوق، آنها همچنان دارای معایبی هستند.این روش ها (جدول 1)، از جمله برخی کاربردها با جزئیات (مزایا و معایب) مقایسه شده اند.
با توسعه میکروسیالات، سیستم های میکروالکترومکانیکی، نانوتکنولوژی و علم مواد، استفاده از تراشه های میکروسیال برای تشخیص بیماری های عفونی به طور مداوم در حال پیشرفت است [55,96,107,108].دستکاری دقیق تجهیزات و مایعات مینیاتوری به دقت تشخیصی و مقرون به صرفه بودن کمک می کند.از این رو برای توسعه بیشتر، تلاش هایی برای بهینه سازی و ارتقای تراشه ها صورت گرفته است که در نتیجه تراشه های میکروسیالی مختلف با ساختارها و عملکردهای متفاوت تولید می شود.در اینجا به طور خلاصه چندین نوع رایج از پلتفرم های میکروسیال را معرفی می کنیم و ویژگی های آنها (مزایا و معایب) را با هم مقایسه می کنیم.علاوه بر این، بیشتر نمونه های ذکر شده در زیر عمدتاً بر مبارزه با SARS-CoV-2 تمرکز دارند.
LOCC ها رایج ترین سیستم های تحلیلی پیچیده کوچک شده هستند و عملیات آنها بسیار کوچک، یکپارچه، خودکار و موازی شده از تزریق و آماده سازی نمونه، کنترل جریان و تشخیص مایع است [109، 110].مایعات از طریق هندسه با دقت طراحی شده و برهمکنش بسیاری از اثرات فیزیکی مانند گرادیان فشار، کنش مویرگی، الکترودینامیک، میدان های مغناطیسی و امواج صوتی دستکاری می شوند [111].LOCC مزایای بسیار خوبی را در غربالگری با توان بالا و تشخیص چندگانه، با سرعت تجزیه و تحلیل سریع، اندازه نمونه کوچک، مصرف انرژی کم، و مدیریت و بهره وری بالا نشان می دهد.با این حال، دستگاه های LOCC بسیار ظریف هستند، و تولید، بسته بندی، و رابط.با این حال، مالتی پلکس و استفاده مجدد با مشکلات عظیمی مواجه است [96].در مقایسه با سایر پلتفرم ها، LOCC دارای مزایای منحصر به فردی از نظر حداکثر تنوع برنامه و بهترین سازگاری با فناوری است، اما معایب آن نیز آشکار است، یعنی پیچیدگی بالا و تکرارپذیری ضعیف.وابستگی به پمپ های خارجی، که اغلب حجیم و گران هستند، استفاده از آنها را در POCT محدودتر می کند.
در طول شیوع COVID-19، LOCC توجه زیادی را به خود جلب کرد.در عین حال، چندین تراشه جدید وجود دارد که چندین فناوری را ترکیب می کند.به عنوان مثال، تلفن های هوشمند اکنون به طور گسترده به عنوان دستگاه های تجزیه و تحلیل قابل حمل استفاده می شوند و پتانسیل بالایی برای یکپارچه سازی LOCC دارند.سان و همکاران[21] یک تراشه میکروسیال ساخت که اجازه می دهد توالی های اسید نوکلئیک خاصی از پنج پاتوژن از جمله SARS-CoV-2 را با استفاده از LAMP مضاعف کند و آنها را با استفاده از تلفن هوشمند ظرف 1 ساعت پس از پایان واکنش تجزیه و تحلیل کرد.به عنوان مثال دیگر، Sundah و همکاران.[112] یک سوئیچ مولکولی [تقویت کاتالیزوری توسط سوئیچ حالت گذار مولکولی (CATCH)] برای تشخیص مستقیم و حساس اهداف RNA SARS-CoV-2 با استفاده از تلفن های هوشمند ایجاد کرد. CATCH با LOCC قابل حمل سازگار است و به عملکرد عالی دست می یابد (تقریباً 8 کپی RNA در میکرولیتر؛ < 1 ساعت در دمای اتاق) [112]. CATCH با LOCC قابل حمل سازگار است و به عملکرد عالی دست می یابد (تقریباً 8 کپی RNA در میکرولیتر؛ < 1 ساعت در دمای اتاق) [112]. CATCH coвместим с портативным LOCC и оеспечивает превосходную производительность (مثلا 8 کپی РНК/мкл؛ < 1 ч при комнатной دما) [112]. CATCH با LOCC قابل حمل سازگار است و توان عملیاتی عالی را ارائه می دهد (تقریباً 8 کپی RNA در میکرولیتر؛ < 1 ساعت در دمای اتاق) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时） CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时） CATCH withвмеstim со портативными LOCC و обладает превосходной производительностью (مثلا 8 کپی РНК/мкл؛ < 1 ساعت در комнатной температуре) [112]. CATCH با LOCC های قابل حمل سازگار است و عملکرد عالی دارد (تقریباً 8 کپی RNA در میکرولیتر؛ < 1 ساعت در دمای اتاق) [112].علاوه بر این، دستگاه های LOCC برای تشخیص مولکولی نیز از برخی نیروهای محرک مانند خلاء، کشش و میدان های الکتریکی استفاده می کنند.کانگ و همکاران[113] یک نانوپلاسما بر روی یک تراشه PCR بلادرنگ و فوق سریع برای تشخیص سریع و کمی COVID-19 در میدان با استفاده از یک تراشه PCR مایع پلاسمونیک خلاء نشان داد.لی و همکاران[114] متعاقباً یک تراشه میکروسیال مبتنی بر کشش را توسعه داد که تشخیص COVID-19 را امکان پذیر کرد.این پلت فرم از سیستم تقویت RT-LAMP برای تعیین اینکه آیا یک نمونه از نظر کیفی مثبت است یا منفی استفاده می کند.متعاقبا راماچاندران و همکاران.[115] با استفاده از ایزوتاخوفورزیس (ITP)، یک تکنیک تمرکز یون انتخابی که در میکروسیالات اجرا شده است، به گرادیان میدان الکتریکی مناسب دست یافت.با ITP، RNA هدف از نمونه‌های خام سواب نازوفارنکس می‌تواند به طور خودکار خالص شود.سپس راماچاندران و همکاران.[115] ترکیب این تصفیه ITP با سنجش LAMP و CRISPR تقویت‌شده با ITP، SARS-CoV-2 را در سواب نازوفارنکس انسان و نمونه‌های بالینی در حدود 35 دقیقه شناسایی کرد.علاوه بر این، ایده های جدید دائما در حال ظهور هستند.جدهاو و همکاران[116] یک طرح تشخیصی مبتنی بر طیف‌سنجی رامان تقویت‌شده سطحی در ترکیب با یک دستگاه میکروسیال حاوی نانولوله‌های کربنی با روکش طلا/نقره جهت عمودی یا میکرو/نانولوله‌های الکتروریسی‌شده یکبار مصرف پیشنهاد کرد.میکروکانال های فیلتر داخلی با عملکرد غشایی یکبار مصرف هستند.این دستگاه ویروس ها را از مایعات / ترشحات مختلف بدن مانند بزاق، نازوفارنکس و اشک جذب می کند.بنابراین، تیتر ویروس فراوان است و ویروس را می توان با امضای رامان به طور دقیق شناسایی کرد.
LOAD یک پلت فرم میکروسیال گریز از مرکز است که در آن تمام فرآیندها توسط یک پروتکل فرکانس کنترل می شوند که یک بستر ریزساختار را می چرخاند [110].دستگاه LOAD با استفاده از نیروی گریز از مرکز به عنوان یک نیروی محرکه مهم مشخص می شود.مایعات نیز تحت تأثیر نیروهای مویرگی، اویلر و کوریولیس قرار دارند.با استفاده از یک دستگاه سانتریفیوژ، آنالیزها در عملکرد مایع پیوسته از یک موقعیت شعاعی به سمت داخل به بیرون انجام می شود و نیاز به لوله های خارجی اضافی، پمپ ها، محرک ها و دریچه های فعال را از بین می برد.به طور خلاصه، یک روش کنترل واحد عملیات را ساده می کند.نیروهای وارد بر مایع در همان کانال میکروسیال در فاصله یکسان از مرکز بار برابر است که امکان تکرار ساختار کانال را فراهم می کند.بنابراین، طراحی و ساخت تجهیزات LOAD ساده تر و مقرون به صرفه تر از تجهیزات LOCC معمولی است، در حالی که واکنش ها تا حد زیادی مستقل و موازی هستند.با این حال، به دلیل استحکام مکانیکی بالای تجهیزات گریز از مرکز، مواد تراشه در دسترس محدود است و حجم کم مشکل است.به ماشیندر عین حال، اکثر دستگاه های LOAD فقط برای یک بار استفاده طراحی شده اند که برای تشخیص در مقیاس بزرگ گران است [96، 117، 118، 119].
در دهه‌های اخیر، LOAD که یکی از امیدوارکننده‌ترین دستگاه‌های میکروسیالی محسوب می‌شود، توجه قابل‌توجهی از سوی محققان و تولیدکنندگان شده است.بنابراین، LOAD مقبولیت گسترده ای به دست آورده است و برای تشخیص مولکولی پاتوژن های عفونی [120، 121، 122، 123، 124]، به ویژه در طول شیوع COVID-19 استفاده شده است.به عنوان مثال، در پایان سال 2020، جی و همکاران.[60] یک سنجش مستقیم RT-qPCR برای تشخیص موازی سریع و خودکار عفونت‌های SARS-CoV-2 و آنفولانزای A و B در نمونه‌های سواب گلو نشان داد.سپس Xiong و همکاران.[74] یک پلت فرم میکروسیال دیسکوئیدی یکپارچه با LAMP برای تشخیص سریع، دقیق و همزمان هفت کروناویروس تنفسی انسانی، از جمله SARS-CoV-2، در عرض 40 دقیقه ارائه کرد.در اوایل سال 2021، دی اولیویرا و همکاران.[73] یک تراشه میکروسیال گریز از مرکز تونر پلی استایرن را نشان داد که به صورت دستی با یک چرخاننده نوک انگشت کار می‌کند، برای تشخیص مولکولی RT-LAMP COVID-19.متعاقباً، دیگنان و همکاران.[39] یک میکرودستگاه سانتریفیوژ قابل حمل خودکار را برای خالص‌سازی RNA SARS-CoV-2 مستقیماً از بخش‌های سواب باکال ارائه کرد.مدود و همکاران[53] یک سیستم نمونه‌برداری آئروسل SARS-CoV-2 خطی با یک تراشه فلورسنت میکروسیالی چرخان با حجم کوچک با محدودیت تشخیص 10 کپی در میکرولیتر و حداقل آستانه چرخه 15 دقیقه پیشنهاد کرد.سوارز و همکاران[75] اخیراً توسعه یک پلت فرم میکروسیال گریز از مرکز مدولار یکپارچه برای تشخیص مستقیم RNA SARS-CoV-2 در نمونه‌های سواب نازوفارنکس غیرفعال شده با حرارت با استفاده از LAMP گزارش کرده است.این مثال‌ها مزایای بزرگ و نویدبخش LOAD را در تشخیص مولکولی COVID-19 نشان می‌دهند.
در سال 1945 مولر و کلگ [125] برای اولین بار کانال های میکروسیال را روی کاغذ با استفاده از کاغذ صافی و پارافین ارائه کردند.در سال 2007، گروه Whitesides [126] اولین پلت فرم کاغذی کاربردی را برای آزمایش پروتئین و گلوکز ایجاد کردند.کاغذ به یک بستر ایده آل برای میکروسیال تبدیل شده است.این کاغذ دارای خواص ذاتی مانند آب دوستی و ساختار متخلخل، زیست سازگاری عالی، وزن سبک، انعطاف پذیری، تاشو، هزینه کم، سهولت استفاده و راحتی است.μPADهای کلاسیک شامل ساختارهای آب دوست/آب گریز هستند که بر روی بسترهای کاغذی ساخته شده اند.بسته به ساختار سه بعدی، μPAD ها را می توان به دو بعدی (2D) و سه بعدی (3D) تقسیم کرد.μPADهای دوبعدی با تشکیل مرزهای آبگریز برای تشکیل کانال‌های میکروسیال تولید می‌شوند، در حالی که میکروپادهای سه بعدی معمولاً از لایه‌هایی از کاغذ میکروسیال دو بعدی، گاهی اوقات با تا کردن کاغذ، تکنیک‌های لغزش، کانال‌های باز و چاپ سه‌بعدی ساخته می‌شوند [96].سیالات آبی یا بیولوژیکی روی μPAD عمدتاً توسط نیروی مویرگی بدون منبع انرژی خارجی کنترل می‌شوند که ذخیره‌سازی اولیه معرف‌ها، جابجایی نمونه و تشخیص مالتی پلکس را تسهیل می‌کند.با این حال، کنترل دقیق جریان و تشخیص مالتی پلکس به دلیل سرعت تشخیص ناکافی، حساسیت و قابلیت استفاده مجدد [96، 127، 128، 129، 130] با مشکل مواجه می شوند.
به عنوان یک پلت فرم میکروسیال غیر معمول، μPAD به طور گسترده برای تشخیص مولکولی بیماری های عفونی مانند HCV، HIV و SARS-CoV-2 ترویج و توسعه یافته است [131، 132].برای تشخیص انتخابی و حساس HCV، Tengam و همکاران.[133] یک حسگر زیستی جدید مبتنی بر کاغذ فلورسنت با استفاده از یک پروب اسید نوکلئیک بسیار خاص بر اساس پپتید پیرولیدینیل توسعه داد.اسیدهای نوکلئیک به صورت کووالانسی بر روی کاغذ سلولز نیمه اکسید شده توسط آلکیلاسیون تقلیل دهنده بین گروه های آمینه و گروه های آلدهیدی بی حرکت می شوند و تشخیص بر اساس فلورسانس است.این سیگنال ها را می توان توسط یک ابزار مخصوص ساخته شده با یک دوربین فلورسنت قابل حمل در ترکیب با یک دوربین تلفن همراه خواند.متعاقبا، لو و همکاران.[134] یک الکترود منعطف مبتنی بر کاغذ مبتنی بر نانوذرات نیکل/طلا/نانولوله های کربنی/کامپوزیت های چارچوب آلی فلزی پلی وینیل الکل برای تشخیص هدف HIV با هیبریداسیون DNA با استفاده از متیلن بلو به عنوان یک شاخص اکسیداسیون و کاهش DNA طراحی کرد.اخیراً، چاودوری و همکاران.[135] یک طرح پلت فرم فرضی برای آزمایش μPAD در نقطه مراقبت با استفاده از بزاق خام بیمار در ترکیب با LAMP و فناوری تصویربرداری قابل حمل برای تشخیص آنالیت COVID-19 ارائه کرد.
آزمایش‌های جریان جانبی، سیال‌ها را توسط نیروهای مویرگی هدایت می‌کنند و حرکت سیال را با ترشوندگی و ویژگی‌های زیرلایه‌های متخلخل یا ریزساختار کنترل می‌کنند.دستگاه های جریان جانبی شامل نمونه، مزدوج، انکوباتور و آشکارساز و پدهای جاذب هستند.مولکول های اسید نوکلئیک در LFA بایندرهای خاصی را می شناسند که از قبل در محل اتصال ذخیره شده و به صورت کمپلکس متصل می شوند.هنگامی که مایع از صفحات انکوباسیون و تشخیص عبور می کند، کمپلکس ها توسط مولکول های جذب واقع در خطوط آزمایش و کنترل گرفته می شوند و نتایجی را نشان می دهند که می توان مستقیماً با چشم غیر مسلح خواند.به طور معمول، LFA را می توان در 2-15 دقیقه تکمیل کرد، که سریعتر از کشف سنتی است.با توجه به مکانیزم خاص، LFA به عملیات کمی نیاز دارد و نیازی به تجهیزات اضافی ندارد، که آن را بسیار کاربر پسند می کند.ساخت و کوچک سازی آن آسان است و هزینه بسترهای کاغذی کمتر است.با این حال، فقط برای تجزیه و تحلیل کیفی استفاده می شود، و تشخیص کمی بسیار دشوار است، و توانایی چندگانه سازی و توان عملیاتی بسیار محدود است، و تنها یک اسید نوکلئیک کافی را می توان در یک زمان تشخیص داد [96,110,127].
اگرچه بیشتر کاربردهای LFA بر روی سنجش ایمنی متمرکز است، استفاده از LFA برای تشخیص مولکولی در تراشه‌های میکروسیال نیز مؤثر و محبوب است [136].در مورد ویروس هپاتیت B، HIV و SARS-CoV-2 LFA Gong و همکاران.[137] یک پلت فرم LFA نانوذره با تبدیل بالا پیشنهاد کرد و تطبیق پذیری این پلت فرم کوچک و قابل حمل را از طریق تشخیص حساس و کمی اهداف متعدد مانند اسید نوکلئیک HBV نشان داد.علاوه بر این، فو و همکاران.[138] یک LFA جدید مبتنی بر طیف‌سنجی رامان تقویت‌شده سطحی برای تجزیه و تحلیل کمی DNA HIV-1 در غلظت‌های پایین نشان دادند.لیو و همکاران برای تشخیص سریع و حساس SARS-CoV-2.[85] یک تجزیه و تحلیل جریان جانبی RPA یکپارچه با میکروسیال را با ترکیب RT-RPA و یک سیستم تشخیص جریان جانبی جهانی در یک سیستم میکروسیال منفرد ایجاد کرد.
کاربرد پلتفرم های میکروسیال مختلف بسته به مطالعات خاص و با بهره گیری کامل از قابلیت ها و مزایای پلت فرم ها متفاوت است.با دریچه‌ها، پمپ‌ها و کانال‌های مقرون‌به‌صرفه، LOCC جامع‌ترین پلتفرم برای تنوع برنامه‌ها و قابلیت همکاری با بزرگترین اتاق برای توسعه است.لذا امیدواریم و توصیه می کنیم که در اولین اقدام جدیدترین مطالعات در LOCC انجام شود و شرایط بهینه شود.علاوه بر این، انتظار می رود روش های کارآمدتر و دقیق تری کشف و در سیستم استفاده شود.LOAD در کنترل دقیق سیالات از دستگاه های LOCC موجود برتری دارد و مزایای منحصر به فردی را در درایوهای تک توسط نیروی گریز از مرکز بدون نیاز به درایوهای خارجی نشان می دهد، در حالی که پاسخ های موازی را می توان جدا و هماهنگ کرد.بنابراین، در آینده، LOAD به پلتفرم میکروسیال اصلی با عملیات دستی کمتر و فناوری های بالغ و خودکار تبدیل خواهد شد.پلت فرم μPAD مزایای LOCC و مواد مبتنی بر کاغذ را برای تشخیص کم هزینه و یک بار مصرف ترکیب می کند.بنابراین، توسعه آینده باید بر روی فناوری های مناسب و به خوبی تثبیت شده تمرکز کند.علاوه بر این، LFA برای تشخیص با چشم غیر مسلح مناسب است و نویدبخش کاهش مصرف نمونه و افزایش سرعت تشخیص است.مقایسه دقیق پلت فرم در جدول 2 نشان داده شده است.
آنالیزهای دیجیتالی نمونه را به ریزراکتورهای زیادی تقسیم می‌کنند که هر یک شامل تعداد مجزایی از مولکول‌های هدف است [139، 140].سنجش دیجیتال مزایای قابل توجهی را برای انجام کمی سازی مطلق با انجام هزاران آزمایش بیوشیمیایی موازی به طور همزمان و جداگانه در محفظه های مقیاس میکرونی به جای یک فاز پیوسته ارائه می دهد.در مقایسه با میکروسیال‌های سنتی، واکنش‌های محفظه می‌توانند حجم نمونه را کاهش دهند، کارایی واکنش را افزایش دهند و به راحتی با سایر روش‌های تحلیلی بدون نیاز به کانال‌ها، پمپ‌ها، دریچه‌ها و طرح‌های فشرده ادغام شوند. 147].دو روش زیر در سنجش دیجیتال برای دستیابی به جداسازی یکنواخت و دقیق محلول‌ها، از جمله معرف‌ها و نمونه‌هایی مانند سلول‌ها، اسیدهای نوکلئیک، و سایر ذرات یا مولکول‌ها استفاده می‌شود:(2) تقسیم آرایه توسط محدودیت های هندسی دستگاه انجام می شود.در روش اول، قطرات حاوی معرف‌ها و نمونه‌ها در میکروکانال‌ها را می‌توان با روش‌های غیرفعال مانند جریان همزمان، جریان متقاطع، تمرکز جریان، امولسیون‌سازی مرحله‌ای، امولسیون میکروکانالی و غشاها از طریق نیروهای برشی ویسکوز و امولسیون با تغییر کانال ایجاد کرد.محلی سازی [143، 145، 146، 148، 149] یا استفاده از روش های فعال [150، 151]، که انرژی اضافی را از طریق کنترل الکتریکی، مغناطیسی، حرارتی و مکانیکی وارد می کند.در رویکرد دوم، بهترین یکنواختی حجم سیال در محفظه‌های میکروسیال با حفظ ساختارهای فضایی با اندازه یکسان، مانند ریز چاله‌ها و آرایه‌های سطحی مشترک است [152،153،154].قابل ذکر است که قطرات بخش‌های جریان اصلی هستند که می‌توانند روی آرایه‌های الکترود مبتنی بر میکروسیال دیجیتال (DMF) تولید و دستکاری شوند.خیس کردن الکتریکی دی الکتریک ها یکی از بهترین تئوری های DMF مطالعه شده است، زیرا خیس شدن الکتریکی دی الکتریک ها امکان دستکاری دقیق قطرات منفرد، کنترل شکل مایع و سیگنال های الکتریکی نامتقارن که از طرف های مختلف عبور می کنند را می دهد [141، 144].عملیات اصلی با قطرات در DMF شامل مرتب سازی، تقسیم و ادغام [151، 155، 156] است که می تواند در زمینه های مختلف تجزیه و تحلیل، به ویژه در تشخیص مولکولی استفاده شود [157، 158، 159].
تشخیص دیجیتال اسید نوکلئیک یک فناوری تشخیصی مولکولی نسل سوم است که به دنبال PCR معمولی و کمی PCR زمان واقعی (qPCR)، به موازات توالی یابی با توان بالا و بیوپسی مایع است.در دو دهه اخیر، اسیدهای نوکلئیک دیجیتال به سرعت در زمینه تشخیص مولکولی پاتوژن های عفونی توسعه یافته اند [160، 161، 162].تعیین کمیت مطلق تشخیص دیجیتال اسید نوکلئیک با بسته‌بندی نمونه‌ها و معرف‌ها در محفظه‌های جداگانه آغاز می‌شود تا اطمینان حاصل شود که هر دنباله هدف احتمال یکسانی برای ورود به هر بخش جداگانه دارد.از نظر تئوری، هر بخش ممکن است چندین توالی هدف اختصاص داده شود، یا ممکن است یک سیستم ریزواکنش مستقل وجود نداشته باشد.از طریق مکانیسم‌های حسی مختلفی که در بالا توضیح داده شد، محفظه‌هایی با توالی‌های هدف میکروبی که سیگنال‌هایی بالاتر از یک آستانه خاص تولید می‌کنند، می‌توانند با چشم غیرمسلح یا توسط ماشین تجسم شوند و به‌عنوان مثبت برچسب‌گذاری شوند، در حالی که سایر محفظه‌هایی که سیگنال‌های زیر آستانه تولید می‌کنند به عنوان مثبت برچسب‌گذاری می‌شوند. .منفی، که سیگنال هر بخش را یک بولی می کند.بنابراین، با محاسبه تعداد محفظه های ایجاد شده و نرخ نتایج مثبت پس از واکنش، می توان نسخه های اصلی نمونه های آزمایشی را با استفاده از فرمول توزیع پواسون بدون نیاز به منحنی استاندارد، که برای آنالیزهای کمی معمولی مورد نیاز است، مطابقت داد. به عنوان qPCR.[163] در مقایسه با روش‌های تشخیص مولکولی سنتی، تشخیص دیجیتال اسید نوکلئیک دارای درجه بالاتری از اتوماسیون، سرعت تجزیه و تحلیل و حساسیت بالاتر، معرف‌های کمتر، آلودگی کمتر، و طراحی و ساخت ساده‌تر است.به این دلایل، استفاده از سنجش‌های دیجیتال، به‌ویژه روش‌های مبتنی بر قطره، برای تشخیص مولکولی، ترکیب تکنیک‌های تقویت و بازخوانی سیگنال، در طول شیوع بحرانی SARS-CoV-2 به خوبی مورد مطالعه قرار گرفته است.به عنوان مثال، یین و همکاران.[164] روش‌های دیجیتال قطره‌ای و PCR سریع را برای تشخیص ژن‌های ORF1ab، N، و RNase P در SARS-CoV-2 در یک تراشه میکروسیالی ترکیب کرد.قابل ذکر است، این سیستم توانست سیگنال مثبت را در عرض 115 ثانیه شناسایی کند، که سریعتر از PCR معمولی است، که نشان دهنده اثربخشی آن در تشخیص نقطه مراقبت است (شکل 7a).دونگ و همکاران[165]، سو و همکاران.[157]، چن و همکاران.[166] و آلتری و همکاران.[167] همچنین از PCR دیجیتال قطره ای (ddPCR) برای شناسایی SARS-CoV-2 در یک سیستم میکروسیال با نتایج چشمگیر استفاده کرد.برای بهبود بیشتر نرخ تشخیص، شن و همکاران.[168] تصویربرداری تراشه مبتنی بر ddPCR را در کمتر از 15 ثانیه بدون استفاده از تکنیک‌های دوخت تصویر به دست آورد و فرآیند فناوری ddPCR را از آزمایشگاه به کاربرد سرعت بخشید.نه تنها از روش های تقویت حرارتی مانند PCR استفاده می شود، بلکه از روش های تقویت همدما نیز برای ساده سازی شرایط واکنش و پاسخ سریع استفاده می شود.لو و همکاران[71] SlipChip را برای تجزیه و تحلیل قطرات توسعه داد، که قادر به تولید قطرات با اندازه های مختلف در تراکم بالا در یک مرحله و تعیین کمیت اسیدهای نوکلئیک SARS-CoV-2 با استفاده از لامپ دیجیتال است (شکل 7b).به عنوان یک فناوری به سرعت در حال تکامل، CRISPR همچنین می تواند نقش مهمی در تشخیص دیجیتال اسید نوکلئیک از طریق تصویربرداری رنگ سنجی راحت و بدون نیاز به لکه های اسید نوکلئیک اضافی ایفا کند.آکرمن و همکارانیک واکنش ماتریس ترکیبی برای ارزیابی چندگانه اسیدهای نوکلئیک ایجاد کرد.[158] 169 ویروس مرتبط با انسان، از جمله SARS-CoV-2، را در قطرات حاوی معرف های تشخیص اسید نوکلئیک مبتنی بر CRISPR-Cas13 در یک سنجش میکرووله شناسایی کردند (شکل 7c).علاوه بر این، تقویت همدما و فناوری CRISPR را می توان در یک سیستم برای ترکیب مزایای هر دو مورد استفاده قرار داد.پارک و همکاران[169] یک سنجش دیجیتال CRISPR/Cas12a در یک تراشه میکروسیال تجاری برای تشخیص SARS-CoV-2 استخراج شده و کشته شده با حرارت بر اساس یک RT-RPA تک مرحله‌ای با تشخیص سیگنال به پس‌زمینه کوتاه‌تر و بالاتر توسعه داده شد. نسبت زمانی، محدوده دینامیکی گسترده تر و حساسیت بهتر (شکل 7d).برخی از توضیحات این نمونه ها در جدول 3 آورده شده است.
پلت فرم دیجیتال معمولی برای تشخیص اسید نوکلئیکa گردش کار سریع دیجیتال PCR شامل چهار مرحله کلیدی است: آماده سازی نمونه، توزیع مخلوط واکنش، فرآیند تقویت، و کمی سازی هدف (اقتباس از [164]).b شماتیک تجزیه و تحلیل قطرات SlipChip را برای تشکیل قطرات در چگالی بالا نشان می دهد (اقتباس از [71]).c نمودار گردش کار CARMEN-Cas13 (اقتباس از [158]).d مروری بر تشخیص دیجیتالی پیشرفته ویروس با CRISPR/Cas در یک گلدان (اقتباس از [169]).W/O آب در روغن، پلی دی متیل سیلوکسان PDMS، واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR، جمع آوری داده های DAQ، مشتق انتگرال متناسب PID، واکنش ماتریس ترکیبی CARMEN برای ارزیابی اسید نوکلئیک مالتیپلکس، SARS-CoV-2، سندرم حاد تنفسی شدید، کروناویروس 2، RT تقویت سیگنال ترانس کریپتاز ریکامبیناز پلیمراز-RPA، S/B در پس زمینه