اخبار

از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.نسخه مرورگری که استفاده می کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد.برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت ارائه می کنیم.
روش‌های برچسب‌گذاری مجاورت آنزیمی مبتنی بر استرهای فعال یا رادیکال‌های فنوکسی به طور گسترده برای نقشه‌برداری پروتئوم‌های درون سلولی و برهم‌کنش‌های پروتئینی در سلول‌های زنده استفاده می‌شوند.با این حال، استرهای فعال کمتر واکنش نشان می دهند و در نتیجه شعاع برچسب گذاری گسترده ای ایجاد می شود و رادیکال های فنوکسی تولید شده توسط تیمار پراکسید می توانند با مسیرهای ردوکس تداخل کنند.در اینجا ما یک روش فعال‌سازی نوری وابسته به برچسب‌گذاری مجاورت (PDPL) را گزارش می‌کنیم که با پیوند ژنتیکی پروتئین حساس‌کننده نور miniSOG به پروتئین مورد علاقه ایجاد شده است.با تحریک نور آبی و کنترل شده توسط زمان قرار گرفتن در معرض، اکسیژن منفرد تولید می‌شود و سپس برچسب‌گذاری پسماندهای هیستیدین توسط کاوشگر آنیلین از نظر مکانی-زمانی حل می‌شود.ما وفاداری بالای آن را از طریق نقشه برداری پروتئوم خاص اندامک نشان می دهیم.مقایسه جانبی PDPL با TurboID پوشش پروتئومی خاص تر و جامع تری از PDPL را نشان می دهد.در مرحله بعد، ما PDPL را به کواکتیواتور رونویسی مرتبط با بیماری BRD4 و لیگاز پارکین E3 اعمال کردیم و متقابل‌های ناشناخته قبلی را یافتیم.با غربالگری بیان بیش از حد، دو بستر ناشناخته، Ssu72 و SNW1، برای پارکین شناسایی شدند که تخریب آن توسط مسیر پروتئازوم یوبیکوئیتیناسیون انجام می شود.
توصیف دقیق شبکه های پروتئینی زیربنای بسیاری از فرآیندهای سلولی بنیادی است.بنابراین، نقشه برداری مکانی و زمانی بسیار دقیق از برهمکنش های پروتئینی، مبنای مولکولی را برای رمزگشایی مسیرهای بیولوژیکی، آسیب شناسی بیماری، و اختلال در این تعاملات برای اهداف درمانی فراهم می کند.برای این منظور، روش هایی که قادر به تشخیص فعل و انفعالات زمانی در سلول ها یا بافت های زنده هستند، بسیار مطلوب هستند.طیف سنجی جرمی تصفیه میل ترکیبی (AP-MS) از گذشته برای شناسایی شرکای اتصال پروتئین های مورد علاقه (POIs) استفاده شده است.با توسعه روش های کمی پروتئومیکس، Bioplex3.0، بزرگترین پایگاه داده شبکه های پروتئینی مبتنی بر AP-MS ایجاد شد.اگرچه AP-MS بسیار قدرتمند است، مراحل لیز و رقت سلولی در جریان کار به سمت برهمکنش‌های اتصال ضعیف و گذرا سوگیری می‌کنند و مصنوعات پس از لیز مانند جفت‌های برهمکنش کاذب را معرفی می‌کنند که فاقد بخش‌بندی قبل از لیز هستند.
برای پرداختن به این مسائل، اسیدهای آمینه غیرطبیعی (UAA) با گروه‌های پیوند متقابل و پلتفرم‌های برچسب‌گذاری آنزیمی نزدیک (PL) (مانند APEX و BioID)5 توسعه یافته‌اند.اگرچه روش UAA با موفقیت در بسیاری از سناریوها اعمال شده است و اطلاعاتی در مورد چسب های پروتئینی مستقیم ارائه می دهد، بهینه سازی محل درج UAA هنوز مورد نیاز است.مهمتر از همه، این یک روش برچسب‌گذاری استوکیومتری است که فاقد یک معکوس کاتالیزوری از رویدادهای برچسب‌گذاری است.در مقابل، روش‌های PL آنزیمی، مانند روش BioID، لیگاز بیوتین مهندسی شده را با POI7 ترکیب می‌کنند، که متعاقباً بیوتین را فعال می‌کند تا یک واسطه استر بیوتینیل-AMP فعال شود.بنابراین، این آنزیم یک "ابر" بیوتین فعال را کاتالیز کرده و آزاد می کند که باقی مانده های لیزین پروگزیمال را نشان می دهد.با این حال، BioID به بیش از 12 ساعت نیاز دارد تا سیگنال برچسب گذاری شده کافی به دست آید، که مانع استفاده از آن با وضوح زمانی می شود.با استفاده از تکامل هدایت شده بر اساس نمایش مخمر، TurboID بر اساس BioID طراحی شده است تا کارآمدتر باشد، اجازه می دهد برچسب گذاری کارآمد با بیوتین در عرض 10 دقیقه، امکان مطالعه فرآیندهای پویاتر را فراهم کند.از آنجایی که TurboID بسیار فعال است و سطوح بیوتین درون‌زا برای برچسب‌گذاری سطح پایین کافی است، برچسب‌گذاری پس‌زمینه زمانی به یک مشکل بالقوه تبدیل می‌شود که برچسب‌گذاری بسیار پیشرفته و زمان‌بندی شده با افزودن بیوتین اگزوژن مورد نیاز باشد.علاوه بر این، استرهای فعال واکنش‌پذیری ضعیفی دارند (t1/2 ~ 5 دقیقه)، که می‌تواند منجر به یک شعاع برچسب‌گذاری بزرگ، به ویژه پس از اشباع پروتئین‌های همسایه با بیوتین 5 شود. در رویکردی دیگر، همجوشی ژنتیکی آسکوربات پراکسیداز مهندسی شده (یعنی بیوتین- رادیکال‌های فنل و اجازه برچسب‌گذاری پروتئین را در عرض یک دقیقه می‌دهد. APEX به طور گسترده برای شناسایی پروتئوم‌های درون سلولی، کمپلکس‌های پروتئین غشایی، و کمپلکس‌های پروتئین سیگنال‌دهنده سیتوزولی استفاده می‌شود. با این حال، نیاز به غلظت‌های بالای پراکسیدها می‌تواند بر پروتئین‌ها یا مسیرهای ردوکس تأثیر بگذارد و باعث اختلال شود. فرآیندهای سلولی
بنابراین، یک روش جدید که قادر به تولید گونه‌های سرکوب‌شده با شعاع برچسب‌دار فعال‌تر با دقت مکانی و زمانی بالا بدون ایجاد اختلال قابل‌توجه در مسیرهای سلولی است، افزوده مهمی به روش‌های موجود خواهد بود. در میان گونه‌های فعال، اکسیژن منفرد به دلیل طول عمر کوتاه و شعاع انتشار محدود (t1/2 < 0.6 میکرو ثانیه در سلول‌ها) توجه ما را برانگیخت. در میان گونه‌های فعال، اکسیژن منفرد به دلیل طول عمر کوتاه و شعاع انتشار محدود (t1/2 < 0.6 میکرو ثانیه در سلول‌ها) توجه ما را برانگیخت. فرم فعال синглетный 13. در میان اشکال فعال، اکسیژن منفرد به دلیل طول عمر کوتاه و شعاع انتشار محدود (t1/2 < 0.6 میکرو ثانیه در سلول ها) توجه ما را به خود جلب کرد.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中泑t1. 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 فرم فعال مشخصی را دنبال کنید. در میان اشکال فعال، اکسیژن منفرد به دلیل طول عمر کوتاه و شعاع انتشار محدود (t1/2 < 0.6 میکرو ثانیه در سلول ها) توجه ما را به خود جلب می کند.گزارش شده است که اکسیژن منفرد به طور تصادفی متیونین، تیروزین، هیستیدین و تریپتوفان را اکسید می کند و آن را برای اتصال به پروب های مبتنی بر آمین یا تیول 14،15 قطبی می کند.اگرچه از اکسیژن منفرد برای برچسب‌گذاری RNA محفظه درون سلولی استفاده شده است، استراتژی‌هایی برای استفاده مجدد از نشانگرهای مجاورت POI درون‌زا ناشناخته باقی مانده‌اند.در اینجا، ما پلتفرمی به نام برچسب‌گذاری مجاورتی وابسته به فعال‌سازی نوری (PDPL) را ارائه می‌کنیم، که در آن از نور آبی برای روشن کردن POIهای ذوب شده با یک حساس‌کننده نوری miniSOG استفاده می‌کنیم و تولید اکسیژن واحد را برای اکسید کردن بقایای پروگزیمال، و به دنبال آن تغییرات حاوی آمین برای اکسید کردن پروب‌های شیمیایی به سلول های زنده میانی.ما گروهی از کاوشگرهای شیمیایی را برای به حداکثر رساندن ویژگی برچسب آزمایش کردیم و سایت‌های اصلاح را با استفاده از یک گردش کار پروتئومیکس باز شناسایی کردیم.مقایسه جانبی PDPL با TurboID پوشش پروتئومی خاص تر و جامع تری از PDPL را نشان می دهد.ما این رویکرد را برای نشانگرهای خاص اندامک پروتئوم درون سلولی و شناسایی پروتئوم عمومی شرکای اتصال برای پروتئین تنظیم‌کننده اپی ژنتیک مرتبط با سرطان BRD4 و پارکین E3 لیگاز مرتبط با بیماری پارکینسون اعمال کردیم، که هم شبکه شناخته‌شده و هم ناشناخته‌ای از پروتئین را تأیید کرد. فعل و انفعالات..توانایی PDPL برای تشخیص سوبستراهای E3 در مجتمع های پروتئینی بزرگ، وضعیتی را نشان می دهد که در آن شناسایی بایندرهای غیرمستقیم مورد نیاز است.دو بستر پارکین ناشناخته با واسطه یوبیکوئیتیناسیون-پروتئازوم در محل تایید شده اند.
درمان فوتودینامیک (PDT)19 و غیرفعال سازی لیزر با کمک کروموفور (CALI)20، که در آن تابش نور با حساس کننده های نوری باعث تولید اکسیژن منفرد می شود، می تواند پروتئین های هدف را غیرفعال کند یا باعث مرگ سلولی شود.از آنجایی که اکسیژن منفرد یک ماده بسیار واکنش پذیر با فاصله انتشار نظری حدود 70 نانومتر است، اکسیداسیون فضایی محدود در اطراف حساس کننده نور قابل کنترل است.بر اساس این مفهوم، ما تصمیم گرفتیم از اکسیژن منفرد برای دستیابی به برچسب گذاری نزدیک کمپلکس های پروتئینی در سلول های زنده استفاده کنیم.ما یک رویکرد شیمی‌پروتئومی PDPL را برای انجام چهار عملکرد توسعه داده‌ایم: (1) برای کاتالیز کردن تولید اکسیژن منفرد فعال مشابه روش آنزیمی PL.(2) پس از شروع نور، برچسب گذاری با زمان حل شده را ارائه دهید.(3) با تغییر (4) از استفاده از کوفاکتورهای درون زا (مانند بیوتین) برای کاهش پس زمینه، یا استفاده از معرف های اگزوژن بسیار مزاحم (مانند پراکسیدها) برای به حداقل رساندن قرار گرفتن سلول در معرض استرس محیطی خودداری کنید.
حساس‌کننده‌های نوری را می‌توان به دو دسته تقسیم کرد که شامل فلوروفورها با وزن مولکولی کوچک (مانند رز بنگال، متیلن آبی) و پروتئین‌های کوچک کدگذاری شده ژنتیکی (مانند miniSOG، KillerRed)23 می‌شود.برای دستیابی به یک طراحی مدولار، ما اولین پلت فرم PDPL را با افزودن پروتئین های حساس کننده نور (PS) به POI24،25 توسعه دادیم (شکل 1a).هنگامی که با نور آبی تابش می‌شود، اکسیژن منفرد باقی‌مانده‌های اسید آمینه نوکلئوفیلیک پروگزیمال را اکسید می‌کند که منجر به قطبیت یکپارچه‌ای می‌شود که الکتروفیل است و می‌تواند بیشتر با هسته‌های پروب آمین واکنش دهد.کاوشگر با یک دسته آلکین طراحی شده است تا امکان شیمی کلیک و پایین کشیدن برای مشخصه LC/MS/MS را فراهم کند.
تصویر شماتیک از برچسب زدن کمپلکس های پروتئینی با واسطه miniSOG.هنگامی که در معرض نور آبی قرار می‌گیرند، سلول‌هایی که miniSOG-POI را بیان می‌کنند، اکسیژن منفرد تولید می‌کنند که پروتئین‌های در حال تعامل را تغییر می‌دهد، اما پروتئین‌های غیر اتصال‌دهنده را تغییر نمی‌دهد.محصولات میانی فوتواکسیداسیون توسط برچسب های رله کاوشگر شیمیایی آمین رهگیری می شوند تا ترکیب های کووالانسی تشکیل دهند.گروه آلکینیل روی کاوشگر شیمی به شیمی کلیک برای غنی‌سازی با پایین کشیدن و سپس کمی‌سازی LC-MS/MS اجازه می‌دهد.b ساختار شیمیایی پروب های آمین 1-4.ج تجزیه و تحلیل ژل فلورسنت نماینده نشانگرهای پروتئومی با واسطه miniSOG موضعی میتوکندری با استفاده از پروب های 1-4 و کمی سازی نسبی بر اساس تراکم سنجی ژل.نسبت سیگنال به پس‌زمینه پروب‌های شیمیایی با استفاده از آزمایش‌های کنترل منفی به استثنای نور آبی یا با استفاده از سلول‌های HEK293T بدون بیان miniSOG ارزیابی شد.n = 2 نمونه مستقل از نظر بیولوژیکی.هر نقطه نشان دهنده یک ماکت بیولوژیکی است.d تشخیص و تعیین کمیت PDPL با استفاده از پروب بهینه 3 در حضور یا عدم حضور اجزای PDPL نشان داده شده مانند c.n = 3 نمونه بیولوژیکی مستقل.هر نقطه نشان دهنده یک ماکت بیولوژیکی است.خطوط مرکزی و سبیل ها میانگین و ± انحراف معیار را نشان می دهند.CBB: Coomassie Brilliant Blue.تصویربرداری کانفوکال از اکسیژن منفرد با رنگ قرمز دور Si-DMA.نوار مقیاس: 10 میکرومترتصویربرداری ژل و آزمایش های کانفوکال به طور مستقل حداقل دو بار با نتایج مشابه تکرار شد.
ما ابتدا توانایی حساس‌کننده‌های نور بالغ miniSOG26 و KillerRed23 را که به طور پایدار در HEK293T بیان می‌شوند، برای واسطه‌گری برچسب‌گذاری پروپارگیلامین پروتئوم به عنوان یک کاوشگر شیمیایی آزمایش کردیم (شکل تکمیلی 1a).تجزیه و تحلیل فلورسانس ژل نشان داد که برچسب زدن کل پروتئوم با استفاده از miniSOG و تابش نور آبی به دست آمد، در حالی که هیچ محصول برچسب‌گذاری قابل مشاهده با KillerRed مشاهده نشد.برای بهبود نسبت سیگنال به پس‌زمینه، مجموعه‌ای از پروب‌های شیمیایی حاوی آنیلین (1 و 3)، پروپیلامین (2)، یا بنزیلامین (4) را آزمایش کردیم.مشاهده کردیم که سلول‌های HEK293T در مقایسه با عدم وجود نور آبی، سیگنال پس‌زمینه بالاتری داشتند، احتمالاً به دلیل حساس‌کننده نور ریبوفلاوین درون‌زا، مونونوکلئوتید فلاوین (FMN) 27. کاوشگرهای شیمیایی مبتنی بر آنیلین 1 و 3 ویژگی بهتری دادند، با HEK293T که به طور پایدار miniSOG را در میتوکندری بیان می‌کند و افزایش 8 برابری سیگنال را برای پروب 3 نشان می‌دهد، در حالی که پروب 2 در روش برچسب‌گذاری RNA استفاده می‌شود، CAP-seq فقط 2.5- را نشان می‌دهد. افزایش سیگنال برابر، احتمالاً به دلیل ترجیحات مختلف واکنش بین RNA و پروتئین (شکل 1b، c). کاوشگرهای شیمیایی مبتنی بر آنیلین 1 و 3 ویژگی بهتری دادند، با HEK293T که به طور پایدار miniSOG را در میتوکندری بیان می‌کند و افزایش 8 برابری سیگنال را برای پروب 3 نشان می‌دهد، در حالی که پروب 2 در روش برچسب‌گذاری RNA استفاده می‌شود، CAP-seq فقط 2.5- را نشان می‌دهد. افزایش سیگنال برابر، احتمالاً به دلیل ترجیحات مختلف واکنش بین RNA و پروتئین (شکل 1b، c).پروب های شیمیایی 1 و 3 مبتنی بر آنیلین ویژگی بهتری را نشان دادند: HEK293T، که به طور پایدار miniSOG را در میتوکندری بیان می کند، بیش از 8 برابر افزایش سیگنال را برای پروب 3 نشان می دهد، در حالی که کاوشگر 2، که در روش برچسب گذاری CAP-seq RNA استفاده می شود، فقط افزایش سیگنال 2.5 برابری را نشان می دهد، احتمالاً به دلیل ترجیحات واکنشی متفاوت بین RNA و پروتئین (شکل 1b، c).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAپروب های شیمیایی 1 و 3 مبتنی بر آنیلین ویژگی بهتری داشتند، HEK293T به طور پایدار miniSOG را در میتوکندری بیان کرد، و پروب 3 بیش از 8 برابر افزایش سیگنال داشت، در حالی که پروب 2 برای روش برچسب گذاری RNA CAP-seq تنها 2.5 برابر افزایش نشان داد.در سیگنال، احتمالاً به دلیل ترجیحات مختلف واکنش بین RNA و پروتئین (شکل 1b, c).علاوه بر این، ایزومرهای پروب 3 و پروب های هیدرازین (پروب های 5، 6، 7) مورد آزمایش قرار گرفتند که بهینه سازی پروب 3 را تایید می کند (شکل تکمیلی 1b,c).به طور مشابه، تجزیه و تحلیل فلورسانس درون ژل، پارامترهای تجربی بهینه شده دیگری را نشان داد: طول موج تابش (460 نانومتر)، غلظت پروب شیمیایی (1 میلی‌مولار)، و زمان تابش (20 دقیقه) (شکل تکمیلی 2a-c).حذف هر جزء یا مرحله در پروتکل PDPL منجر به برگشت سیگنال قابل توجه به پس زمینه شد (شکل 1d).قابل ذکر است، برچسب زدن پروتئین در حضور آزید سدیم یا ترولوکس به طور قابل توجهی کاهش یافت، که شناخته شده برای خاموش کردن اکسیژن منفرد هستند.وجود D2O، که به عنوان تثبیت کننده اکسیژن منفرد شناخته می شود، سیگنال برچسب زدن را افزایش می دهد.برای بررسی نقش سایر گونه‌های اکسیژن فعال در برچسب‌گذاری، مانیتول و ویتامین C به ترتیب برای ایجاد جاذب‌های رادیکال هیدروکسیل و سوپراکسید به ترتیب، 18، 29 اضافه شدند، اما مشخص نشد که برچسب‌گذاری را کاهش دهند.افزودن H2O2، اما نه روشنایی، منجر به برچسب زدن نشد (شکل تکمیلی 3a).تصویربرداری اکسیژن منفرد فلورسانس با پروب های Si-DMA وجود اکسیژن منفرد را در سیم HEK293T-miniSOG تایید کرد، اما در سیم HEK293T اصلی نه.علاوه بر این، mitoSOX Red نمی تواند تولید سوپراکسید را پس از روشنایی تشخیص دهد (شکل 1e و شکل تکمیلی 3b).سمیت سلولی PDPL از جمله تابش نور آبی و پروب های شیمیایی ارزیابی شد و سمیت سلولی قابل توجهی مشاهده نشد (شکل تکمیلی 4a).
به منظور مطالعه مکانیسم برچسب‌گذاری و فعال کردن شناسایی پروتئومی کمپلکس‌های پروتئینی با استفاده از LC-MS/MS، ابتدا باید مشخص کنیم که کدام اسیدهای آمینه اصلاح شده‌اند و جرم دلتا برچسب‌های پروب.متیونین، هیستیدین، تریپتوفان و تیروزین گزارش شده است که توسط اکسیژن منفرد اصلاح می شوند 14،15.ما گردش کار TOP-ABPP31 را با جستجوی باز بی طرفانه ارائه شده توسط پلت فرم محاسباتی FragPipe بر اساس MSFragger32 یکپارچه می کنیم.پس از اصلاح اکسیژن منفرد و برچسب زدن پروب شیمیایی، شیمی کلیک با استفاده از یک برچسب کاهش بیوتین حاوی یک پیوند دهنده قابل شکافت و به دنبال آن کشش نوتراویدین و هضم تریپسین انجام شد.پپتید اصلاح شده که هنوز به رزین متصل است، برای تجزیه و تحلیل LC-MS/MS فتوکلیو شد (شکل 2a و داده های تکمیلی 1).تعداد زیادی از تغییرات در سراسر پروتئوم با بیش از 50 نقشه پپتیدی (PSM) مطابق فهرست شده (شکل 2b) رخ داده است.با کمال تعجب، ما فقط تغییرات هیستیدین را مشاهده کردیم، احتمالاً به دلیل واکنش پذیری بالاتر هیستیدین اکسید شده نسبت به پروب های آنیلین نسبت به سایر اسیدهای آمینه.با توجه به مکانیسم منتشر شده اکسیداسیون هیستیدین توسط اکسیژن منفرد، 21،33 ساختار دلتا توده پیشنهادی 229 + Da مربوط به ترکیب اضافی پروب 3 با 2-oxo-histidine پس از دو اکسیداسیون است، در حالی که +247 Da محصول هیدرولیز است. از +229 Da (شکل تکمیلی 5).ارزیابی طیف MS2 قابلیت اطمینان بالایی در شناسایی بیشتر یون‌های y و b، از جمله شناسایی یون‌های قطعه اصلاح‌شده (y و b) نشان داد (شکل 2c).تجزیه و تحلیل زمینه توالی محلی هیستیدین های اصلاح شده با PDPL ترجیح موتیف متوسطی را برای باقیمانده های آبگریز کوچک در موقعیت های 1± نشان داد (شکل تکمیلی 4b).به طور متوسط، 1.4 هیستیدین در هر پروتئین شناسایی شد، و محل این نشانگرها با سطح قابل دسترسی حلال (SASA) و تجزیه و تحلیل دسترسی به حلال نسبی (RSA) تعیین شد (شکل تکمیلی 4c,d).
یک گردش کار بی طرف برای مطالعه انتخاب پذیری باقیمانده با استفاده از پلت فرم محاسباتی FragPipe که توسط MSFragger طراحی شده است.پیوندهای قابل جداسازی در شیمی کلیک استفاده می شود تا امکان جداسازی پپتیدهای اصلاح شده از رزین استرپتاویدین را فراهم کند.جستجوی باز برای شناسایی تغییرات متعدد و همچنین بقایای مربوطه راه اندازی شد.b انبوه تغییراتی را که در سرتاسر پروتئوم اتفاق می‌افتد اختصاص دهید.نقشه برداری پپتید PSM.c حاشیه نویسی طیفی MS2 از سایت های هیستیدین اصلاح شده با پروب 3. به عنوان نمونه ای نماینده، یک واکنش کووالانسی با پروب 3 +229.0938 Da به اسید آمینه اصلاح شده اضافه کرد.d سنجش جهش برای آزمایش نشانگرهای PDPL استفاده می شود.PRDX3 (H155A، H225A) و PRDX1 (H10A، H81A، H169A) با پلاسمیدهای نوع وحشی برای تشخیص ضد پرچم ترانسفکت شدند.پپتید مصنوعی با miniSOG خالص در حضور پروب 3 واکنش نشان داد و محصولات مربوطه با Δm +247 و +229 در طیف LC-MS مشاهده شد.فعل و انفعالات پروتئین به پروتئین در شرایط آزمایشگاهی با miniSOG-6xHis-tag و آنتی بادی anti-6xHis مدل شده است.آنتی بیوتین (استرپتاویدین-HRP) و آنالیز وسترن بلات ضد موش مجتمع های آنتی بادی miniSOG-6xHis/anti-6xHis که با پروب 3 برچسب گذاری شده اند، بسته به زمان قرار گرفتن در معرض نور.برچسب‌ها برای پروتئین‌های فردی در وزن مولکولی مربوطه بیان می‌شوند: زنجیره سبک آنتی‌بادی LC، زنجیره سنگین آنتی‌بادی HC.این آزمایش ها به طور مستقل حداقل دو بار با نتایج مشابه تکرار شدند.
برای تأیید بیوشیمیایی محل برچسب‌گذاری، PRDX3 و PRDX1 شناسایی شده توسط طیف‌سنجی جرمی از هیستیدین به آلانین تغییر یافته و در سنجش ترانسفکشن با نوع وحشی مقایسه شدند.نتایج PDPL نشان داد که جهش به طور قابل توجهی برچسب گذاری را کاهش می دهد (شکل 2d).در همین حال، توالی‌های پپتیدی شناسایی‌شده در جستجوی باز سنتز شدند و در شرایط آزمایشگاهی با miniSOG خالص شده در حضور کاوشگر 3 و نور آبی واکنش نشان دادند، محصولاتی با تغییر جرم 247+ و 229+ دا زمانی که توسط LC-MS شناسایی شدند (شکل . 2e).).برای آزمایش اینکه آیا پروتئین‌های پروگزیمال در حال تعامل می‌توانند در شرایط آزمایشگاهی در پاسخ به فعال‌سازی نوری miniSOG برچسب‌گذاری شوند، ما یک سنجش نزدیکی مصنوعی با برهم‌کنش بین پروتئین miniSOG-6xHis و آنتی‌بادی مونوکلونال anti-His در شرایط آزمایشگاهی طراحی کردیم (شکل 2f).در این روش، ما انتظار داشتیم که زنجیره های سنگین و سبک آنتی بادی با miniSOG نشاندار شوند.در واقع، وسترن بلات ضد موش (با تشخیص زنجیره‌های سنگین و سبک آنتی‌بادی با برچسب anti-6xHis) و استرپتاویدین، بیوتینیلاسیون قوی زنجیره‌های سنگین و سبک را نشان داد.قابل‌توجه، ما متوجه اتوبیوتینیلاسیون miniSOG به دلیل برچسب 6xHis و پیوندهای متقابل بین زنجیره‌های سبک و سنگین شدیم، که ممکن است مربوط به شکاف توصیف‌شده قبلی بین پاسخ پروگزیمال لیزین و 2-oxo-histidine باشد.در نتیجه، نتیجه می گیریم که PDPL هیستیدین را به شیوه ای وابسته به مجاورت تغییر می دهد.
هدف بعدی ما مشخص کردن پروتئوم درون سلولی برای آزمایش ویژگی برچسب‌گذاری درجا بود.بنابراین، ما به طور پایدار miniSOG را در هسته، ماتریکس میتوکندری یا غشای ER بیرونی سلول‌های HEK293T بیان کردیم (شکل 3a).تجزیه و تحلیل فلورسانس ژل نوارهای برچسب گذاری شده فراوان را در سه مکان درون سلولی و همچنین الگوهای مختلف برچسب گذاری نشان داد (شکل 3b).آنالیز تصویربرداری فلورسانس ویژگی بالای PDPL را نشان داد (شکل 3c).جریان کار PDPL با واکنش‌های کلیکی با رنگ‌های رودامین برای ترسیم پروتئوم‌های درون سلولی با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس دنبال شد، و سیگنال‌های PDPL با DAPI، ردیاب‌های میتوکندری یا ردیاب‌های ER کلوکالیزه شدند و وفاداری بالای PDPL را تأیید کردند.برای سه مکان اندامک، یک مقایسه جانبی PDPL با TurboID با استفاده از وسترن بلات آویدین نشان داد که PDPL در مقایسه با کنترل‌های مربوطه به طور خاص تری برچسب‌گذاری شده است.تحت شرایط PDPL، نوارهای نشاندار بیشتری ظاهر شد که نشان دهنده پروتئین های نشاندار شده با PDPL بیشتر است (شکل تکمیلی 6a-d).
یک نمایش شماتیک از برچسب زدن پروتئوم اندامک خاص با واسطه miniSOG.miniSOG ماتریکس میتوکندری را از طریق همجوشی با 23 اسید آمینه N ترمینال COX4 انسانی (mito-miniSOG)، هسته را از طریق همجوشی با H2B (هسته-miniSOG) و Sec61β از طریق سمت سیتوپلاسمی غشای ER (ER-miniSOG) هدف قرار می دهد. ).نشانه ها شامل تصویربرداری ژل، تصویربرداری کانفوکال و طیف سنجی جرمی است.b تصاویر ژل نمایندگی از سه پروفایل PDPL خاص اندامک.CBB Coomassie Brilliant Blue.c تصاویر کانفوکال نماینده سلول‌های HEK293T که به طور پایدار miniSOG را با مکان‌های درون سلولی مختلف بیان می‌کنند که توسط آنتی‌بادی نشان‌دار V5 (قرمز) شناسایی شده‌اند.نشانگرهای درون سلولی برای میتوکندری و ER (سبز) استفاده می شود.گردش کار PDPL شامل تشخیص پروتئوم‌های درون سلولی با برچسب miniSOG (زرد) با استفاده از شیمی کلیک Cy3-azide است.نوار مقیاس: 10 میکرومترd نمودارهای آتشفشانی پروتئوم‌های برچسب‌گذاری‌شده با PDPL در اندامک‌های مختلف کمی‌سازی شده توسط کمی‌سازی بدون برچسب (n = 3 آزمایش بیولوژیکی مستقل).از آزمون t Student's Two-tailed در کرت های آتشفشانی استفاده شد.نوع وحشی HEK293T به عنوان کنترل منفی استفاده شد. پروتئین‌هایی که به‌طور قابل‌توجهی تغییر کرده‌اند با رنگ قرمز مشخص می‌شوند (P <0.05 و > 2 برابر تفاوت شدت یون). پروتئین‌هایی که به‌طور قابل‌توجهی تغییر کرده‌اند با رنگ قرمز مشخص می‌شوند (P <0.05 و > 2 برابر تفاوت شدت یون). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 و >2-кратная разница в интенсивности ионов). پروتئین های تغییر یافته به طور قابل توجهی با رنگ قرمز مشخص می شوند (P <0.05 و > 2 برابر تفاوت در شدت یون).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в јоной силе). پروتئین های تغییر یافته به طور قابل توجهی با رنگ قرمز مشخص می شوند (p <0.05 و > 2 برابر تفاوت در قدرت یونی).پروتئین های مرتبط برای HEK293T-miniSOG مهم اما برای HEK293T مهم نیستند به رنگ سبز نشان داده شده اند.تجزیه و تحلیل ویژگی مجموعه داده های پروتئومی از آزمایشات د.تعداد کل پروتئین های آماری معنی دار در هر اندامک (نقاط قرمز و سبز) در بالا مشخص شده است.هیستوگرام ها پروتئین های بومی سازی شده در اندامک ها را بر اساس MitoCarta 3.0، تجزیه و تحلیل GO و A. Ting و همکاران نشان می دهند.مردم.مجموعه داده های جداگانه برای میتوکندری، هسته و ER.این آزمایش ها به طور مستقل حداقل دو بار با نتایج مشابه تکرار شدند.داده های خام در قالب فایل های داده خام ارائه می شوند.
با تشویق نتایج ژل و تصویربرداری، از کمی‌سازی بدون برچسب برای تعیین کمیت پروتئوم شناسایی‌شده در هر اندامک استفاده شد (داده‌های تکمیلی 2).HEK293T ترانسفکت نشده به عنوان یک کنترل منفی برای تفریق نشانگرهای پس زمینه استفاده شد. تجزیه و تحلیل نمودار آتشفشان پروتئین های غنی شده قابل توجهی (p <0.05 و > 2 برابر شدت یون) و همچنین پروتئین های تک تنه را نشان داد که فقط در خطوط بیان کننده miniSOG وجود دارند (شکل 3d نقاط قرمز و سبز). تجزیه و تحلیل نمودار آتشفشان پروتئین های غنی شده قابل توجهی (p <0.05 و > 2 برابر شدت یون) و همچنین پروتئین های تک تنه را نشان داد که فقط در خطوط بیان کننده miniSOG وجود دارند (شکل 3d نقاط قرمز و سبز). Analiz Graphica вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 و > 2-кратная интенсивность ионов)، а также رنگهای سبز سبز، которые присутствуют только в линиях, 05 и 3. تجزیه و تحلیل نمودار آتشفشان پروتئین های غنی شده قابل توجهی (p<0.05 و شدت یون >2 برابر) و همچنین پروتئین های منفرد را نشان داد که فقط در خطوط بیان کننده miniSOG وجود دارند (شکل 3d، نقاط قرمز و سبز).火山图分析显示出显着富集的蛋白质（p < 0.05 和>2 倍离子强度）以及仅存在于miniSOG 表达系中的单一蛋白质（图3d 红色和绿色点）。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Analiz Graphica вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 و> 2x ionnaya сила)، а также отдельные белки، присутствующие только в экспрессионной خطوط miniSOG (красные) miniSOG (красн). تجزیه و تحلیل نمودار آتشفشان پروتئین های غنی شده قابل توجهی را نشان داد (p<0.05 و قدرت یونی >2x) و همچنین پروتئین های منفرد تنها در خط بیان miniSOG (نقاط قرمز و سبز در شکل 3d) وجود دارد.با ترکیب این داده ها، ما به ترتیب 1364، 461 و 911 پروتئین غشای خارجی هسته، میتوکندری و ER را شناسایی کردیم.برای تجزیه و تحلیل دقت PDPL موضعی اندامک، از MitoCarta 3.0، ژن هستی شناسی (GO) تجزیه و تحلیل و A. Ting و همکاران استفاده کردیم.یک مجموعه داده 8 برای میتوکندری، هسته و ER برای آزمایش ویژگی اندامک پروتئین های شناسایی شده، مربوط به دقت 73.4، 78.5، و 73.0٪ استفاده شد (شکل 3e).ویژگی PDPL تأیید می کند که PDPL یک ابزار ایده آل برای شناسایی پروتئوم های خاص اندامک است.قابل توجه، تجزیه و تحلیل سابتوکندریایی پروتئین‌های میتوکندری شناسایی شده نشان داد که پروتئوم به دام افتاده عمدتاً در ماتریکس و غشای داخلی (به ترتیب 226 و 106) توزیع شده است که 91.7٪ (362) از تعداد کل پروتئین‌های میتوکندری شناسایی شده را تشکیل می‌دهد.سطح بالایی از PDPL نیز تأیید شد (شکل تکمیلی 7a).به طور مشابه، تجزیه و تحلیل زیر هسته ای نشان داد که پروتئوم دستگیر شده عمدتاً در هسته، نوکلئوپلاسم و هسته توزیع شده است (شکل تکمیلی 7b).آنالیز پروتئومی هسته ای با پپتید سیگنال محلی سازی هسته ای (3xNLS) دقت مشابهی را با ساختار H2B نشان داد (شکل تکمیلی 7c-h).برای تعیین ویژگی نشانگر PDPL، لامینین هسته‌ای A به‌عنوان تله POI7 محلی‌سازی شده‌تر انتخاب شد.PDPL 36 پروتئین غنی شده را شناسایی کرد که از این تعداد 12 پروتئین (30.0٪ شامل لامین A) پروتئین های متقابل لامین A با مشخصه خوبی بودند که توسط پایگاه داده String مشروح شده بودند، با درصد بالاتری نسبت به روش BioID (122 پروتئین) 28 از 28، 22.9. ٪ 7. روش ما پروتئین های کمتری را شناسایی کرد، احتمالاً به دلیل مناطق برچسب گذاری محدود، که با اکسیژن منفرد فعال تر امکان پذیر شد.تجزیه و تحلیل GO نشان داد که پروتئین های شناسایی شده عمدتاً در نوکلئوپلاسم (26)، غشای هسته ای (10)، غشای هسته ای (9) و منافذ هسته ای (5) قرار دارند.در مجموع، این پروتئین‌های موضعی هسته‌ای 80 درصد از پروتئین‌های غنی‌شده را تشکیل می‌دهند، که بیشتر ویژگی PDPL را نشان می‌دهد (شکل تکمیلی 8a-d).
پس از ایجاد توانایی PDPL برای انجام علامت گذاری مجاورت در اندامک ها، سپس آزمایش کردیم که آیا PDPL می تواند برای تجزیه و تحلیل شرکای اتصال POI استفاده شود یا خیر.به طور خاص، ما به دنبال تعریف آنالیز PDPL پروتئین‌های سیتوزولی بودیم، که به دلیل ماهیت بسیار پویا، اهداف دشوارتری نسبت به همتایان موضعی غشایی خود در نظر گرفته می‌شوند.برومدامین و پروتئین خارج از پایانه (BET) BRD4 به دلیل نقش کلیدی خود در بیماری های مختلف توجه ما را به خود جلب کرده است 35، 36.کمپلکس تشکیل شده توسط BRD4 یک فعال کننده رونویسی و یک هدف درمانی مهم است.تصور می‌شود که با تنظیم بیان فاکتورهای رونویسی c-myc و Wnt5a، BRD4 یک عامل تعیین‌کننده کلیدی لوسمی میلوئید حاد (AML)، مولتیپل میلوم، لنفوم بورکیت، سرطان روده بزرگ و بیماری‌های التهابی است.علاوه بر این، برخی از ویروس‌ها BRD4 را برای تنظیم رونویسی ویروسی و سلولی مورد هدف قرار می‌دهند، مانند ویروس پاپیلوم، HIV و SARS-CoV-236،39.
برای ترسیم برهمکنش BRD4 با استفاده از PDPL، miniSOG را با ایزوفرم کوتاه N یا C ترمینال BRD4 ترکیب کردیم.نتایج پروتئومیک درجه بالایی از همپوشانی بین دو ساختار را نشان داد (شکل تکمیلی 9a).پروتئوم هسته ای شناسایی شده با miniSOG-H2B 77.6 درصد از پروتئین های در تعامل با BRD4 را پوشش می دهد (شکل تکمیلی 9b).سپس، زمان‌های مختلف روشنایی (2، 5، 10، 20 دقیقه) برای تنظیم شعاع نشانگر استفاده شد (شکل 4a و داده‌های تکمیلی 3).نتیجه می‌گیریم که در دوره‌های نوری کوتاه‌تر، PDPL در درجه اول شرکای اتصال مستقیم را برچسب‌گذاری می‌کند، در حالی که دوره‌های طولانی‌تر شامل پروتئین‌هایی است که در طول دوره‌های فعال‌سازی نوری کوتاه‌تر و همچنین اهداف غیرمستقیم در مجتمع‌های برچسب‌گذاری شناسایی شده‌اند.در واقع، همپوشانی قوی بین نقاط زمانی مجاور پیدا کردیم (84.6٪ برای 2 و 5 دقیقه؛ 87.7٪ برای 5 و 10 دقیقه؛ 98.7٪ برای 10 و 20 دقیقه) (شکل 4b و شکل تکمیلی 9c).در همه گروه‌های آزمایشی، ما نه تنها خود برچسب‌گذاری BRD4، بلکه چندین هدف شناخته‌شده مانند MED1، CHD8، BICRA، NIPBL، SMC1A و HMGB1 را یافتیم که در پایگاه‌داده رشته‌ای مشروح شده‌اند.قدرت یونی این اهداف متناسب با زمان نوردهی است (شکل 4c و شکل تکمیلی 9d).تجزیه و تحلیل GO از پروتئین های شناسایی شده در گروه 2 دقیقه ای نشان داد که پروتئین های شناسایی شده در هسته قرار دارند و در بازسازی کروماتین و عملکرد RNA پلیمراز نقش دارند.عملکرد مولکولی پروتئین در اتصال کروماتین یا فعال سازی رونویسی، مطابق با عملکرد BRD4 غنی شد (شکل 4d).تجزیه و تحلیل برهمکنش پروتئین مبتنی بر پایگاه داده رشته‌ای، اولین سطح از برهمکنش‌های غیرمستقیم بین کمپلکس‌های برهمکنش خانواده BRD4 و HDAC مانند SIN3A، NCOR2، BCOR، و SAP130 را نشان داد (شکل 4e و شکل تکمیلی 9e)، مطابق با هیستون‌های استیله شده اتصال‌دهنده BRD4 و HDAC. ..علاوه بر این، اهداف نماینده شناسایی شده توسط LC-MS/MS، از جمله Sin3A، NSUN2، Fus، و SFPQ، توسط وسترن بلات تایید شدند (شکل 4f).اخیراً گزارش شده است که ایزوفرم کوتاه BRD4 هسته هایی با ویژگی های جداسازی فاز مایع-مایع (LLPS) تشکیل می دهد.پروتئین های اتصال RNA Fus و SFPQ واسطه LLPS فرآیندهای سلولی مختلف هستند و در اینجا به عنوان پروتئین های اتصال ثبت نشده BRD4 شناسایی شده اند.برهمکنش بین BRD4 و SFPQ توسط آزمایش‌های هم‌رسوب ایمنی (co-IP) تأیید شد (شکل 4g)، که مکانیسم دیگری را برای جداسازی فاز مایع- مایع با واسطه BRD4 نشان می‌دهد که مستحق بررسی بیشتر است.روی هم رفته، این نتایج نشان می‌دهد که PDPL یک پلت فرم ایده‌آل برای شناسایی پروتئین‌های متصل شونده ناشناخته با BRD4 است.
یک نمایش شماتیک از علامت‌گذاری مجاورت BRD4 با واسطه miniSOG، زمان‌های نوردهی: 2، 5، 10 و 20 دقیقه.b همپوشانی پروتئین های شناسایی شده در زمان های مختلف روشنایی.غنی‌سازی پروتئین شناسایی‌شده در HEK293T-miniSOG-BRD4 در مقایسه با نوع وحشی HEK293T از نظر آماری معنی‌دار بود.c شدت یون هنگام تعیین کمیت پروتئین های شناخته شده متصل به BRD4 نماینده نشاندار نشده در طول زمان قرار گرفتن در معرض مشخص.n = 3 نمونه بیولوژیکی مستقل.داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه می شوند.تجزیه و تحلیل هستی شناسی ژن (GO) پروتئین های شناسایی شده در گروه 2 دقیقه ای.ده عبارت اول GO فهرست شده است.حباب ها بر اساس دسته بندی اصطلاح GO رنگ می شوند و اندازه حباب متناسب با تعداد پروتئین های موجود در هر عبارت است.تجزیه و تحلیل رشته پروتئین های در حال تعامل با BRD4.دایره های زرد چسب مستقیم و دایره های خاکستری اولین لایه چسب غیر مستقیم هستند.خطوط قرمز نشان دهنده برهمکنش های آزمایشی تعیین شده و خطوط آبی نشان دهنده تعاملات پیش بینی شده است.F اهداف اتصال نماینده BRD4 شناسایی شده در LC-MS/MS توسط وسترن بلات تأیید شد.g آزمایش‌های تشدید ایمنی، تعامل بین SFPQ و BRD4 را تأیید می‌کنند.این آزمایش ها به طور مستقل حداقل دو بار با نتایج مشابه تکرار شدند.داده های خام در قالب فایل های داده خام ارائه می شوند.
علاوه بر شناسایی اهداف مرتبط با POI ثبت نشده، ما فرض می‌کنیم که PDPL برای شناسایی سوبستراهای آنزیم‌ها مناسب خواهد بود، که به شناسایی پروتئین‌های اتصال غیرمستقیم در مجتمع‌های بزرگ برای حاشیه‌نویسی سوبستراهای ثبت نشده نیاز دارد.پارکین (کدگذاری شده توسط PARK2) یک لیگاز E3 است و جهش در پارکین به عنوان عامل بیماری پارکینسون نوجوانان اتوزومال مغلوب (AR-JP)42 شناخته شده است.علاوه بر این، پارکین برای میتوفاژی (اتوفاژی میتوکندری) و حذف گونه‌های فعال اکسیژن ضروری توصیف شده است.با این حال، اگرچه چندین بستر پارکین شناسایی شده است، نقش پارکین در این بیماری نامشخص است.برای حاشیه نویسی زیرلایه های بدون مشخصه آن، PDPL با افزودن miniSOG به انتهای N یا C پارکین آزمایش شد.سلول ها با ناقل پروتون کربونیل سیانید m-chlorophenylhydrazone (CCCP) برای فعال کردن پارکین از طریق مسیر PINK1-Parkin تحت درمان قرار گرفتند.در مقایسه با نتایج BRD4 PDPL ما، همجوشی انتهای N پارکین مجموعه بزرگتری از پروتئین‌های هدف را نشان داد، اگرچه بخش بزرگ‌تری از پایانه C (177 از 210) را پوشش می‌دهد (شکل 5a،b و داده‌های تکمیلی 4).نتیجه با گزارش‌هایی مطابقت دارد که نشان می‌دهند N ترمینال می‌توانند به‌طور نابهنجار Parkin44 را فعال کنند.با کمال تعجب، تنها 18 پروتئین همپوشانی در داده های ما با نتایج AP-MS منتشر شده برای پارکین43 وجود داشت که احتمالاً به دلیل تفاوت بین خطوط سلولی و جریان کار پروتئومیکس است.علاوه بر چهار پروتئین شناخته شده (ARDM1، HSPA8، PSMD14 و PSMC3) که با دو روش شناسایی شدند (شکل 5c)43.برای تایید بیشتر نتایج LC-MS/MS، درمان PDPL و متعاقب آن وسترن بلات برای مقایسه نتایج سنجش سلول مادر HEK293T و خط پارکین ترمینال N پایدار مورد استفاده قرار گرفت.اهداف ناشناخته قبلی CDK2، DUT، CTBP1، و PSMC4 با بایندر شناخته شده DNAJB1 آزمایش شدند (شکل 5d).
نمودار آتشفشانی از پروتئین‌های برهم‌کنش پارکین در سلول‌های HEK293T با miniSOG بیان شده پایدار که به انتهای N یا C پارکین ذوب شده‌اند (n = 3 آزمایش بیولوژیکی مستقل).از آزمون t Student's Two-tailed در کرت های آتشفشانی استفاده شد.HEK293T به عنوان کنترل منفی استفاده شد. پروتئین‌هایی که به‌طور قابل‌توجهی تغییر کرده‌اند با رنگ قرمز مشخص می‌شوند (P <0.05 و > 2 برابر تفاوت شدت یون). پروتئین‌هایی که به‌طور قابل‌توجهی تغییر کرده‌اند با رنگ قرمز مشخص می‌شوند (P <0.05 و > 2 برابر تفاوت شدت یون). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 و >2-кратная разница в интенсивности ионов). پروتئین های تغییر یافته به طور قابل توجهی با رنگ قرمز مشخص می شوند (P <0.05 و > 2 برابر تفاوت در شدت یون).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в јоной силе). پروتئین های تغییر یافته به طور قابل توجهی با رنگ قرمز مشخص می شوند (p <0.05 و > 2 برابر تفاوت در قدرت یونی).پروتئین های مرتبط برای HEK293T-miniSOG مهم اما برای HEK293T مهم نیستند به رنگ سبز نشان داده شده اند.b نمودار ون که پروتئین های همپوشانی بین ساختارهای ترمینال N و C ترمینال را نشان می دهد.تگ های ترمینال N می توانند به طور نابهنجار پارکین را فعال کنند و منجر به پروتئین های قابل تشخیص بیشتری شوند.c نمودار ون که پروتئین های همپوشانی بین PDPL و AP-MS را نشان می دهد.برهم کنش های شناخته شده فهرست شده اند، از جمله 4 پروتئین از 18 پروتئین همپوشانی و 11 پروتئین از 159 پروتئین که به طور خاص در PDPL شناسایی شده اند.d اهداف نماینده شناسایی شده توسط LC-MS/MS توسط وسترن بلات تایید شدند.e Ssu72 و SNW1 به عنوان بسترهای پارکین ثبت نشده شناسایی شدند.این پلاسمیدهای پروتئینی دارای برچسب FLAG به HEK293T و HEK293T-Parkin-miniSOG و سپس درمان CCCP در مقاطع زمانی مختلف ترانسفکت شدند.تخریب در خط بیان بیش از حد پارکین بارزتر بود.با استفاده از بازدارنده پروتئازوم MG132، تایید شد که فرآیند تخریب Ssu72 و SNW1 توسط پروتئازوم-ubiquitination واسطه می‌شود.این آزمایش ها به طور مستقل حداقل دو بار با نتایج مشابه تکرار شدند.داده های خام در قالب فایل های داده خام ارائه می شوند.
قابل ذکر است، پروتئین های شناسایی شده توسط PDPL باید شامل پروتئین های متصل کننده پارکین و بسترهای آنها باشد.برای شناسایی سوبستراهای پارکین ثبت نشده، ما هفت پروتئین شناسایی شده (PUF60، PSPC1، UCHL3، PPP1R8، CACYBP، Ssu72 و SNW1) را انتخاب کردیم و پلاسمیدهایی را ترانسفکت کردیم تا این ژن ها را در معرض HEK293T طبیعی قرار دهیم و به طور پایدار تیمار miniSOG-Parkin'sParkin's CC9 را به دنبال HEK2 بیان کنیم.سطوح پروتئین های Ssu72 و SNW1 به طور قابل توجهی در خط پایدار miniSOG-Parkin کاهش یافت (شکل 5e).درمان با CCCP به مدت 12 ساعت منجر به تخریب قابل توجه هر دو بستر شد.برای بررسی اینکه آیا تخریب Ssu72 و SNW1 توسط پروتئازوم-یوبی کوئیتیناسیون تنظیم می شود، مهارکننده پروتئازوم MG132 برای مهار فعالیت پروتئازوم اضافه شد و در واقع متوجه شدیم که روند تخریب آنها مهار شده است (شکل 5f).اهداف غیر بستر اضافی با استفاده از وسترن بلات (تصویر تکمیلی 10)، که نتایج ثابتی را با LC-MS/MS نشان داد، به عنوان برهم کنش های پارکین تأیید شد.در نتیجه، ادغام جریان کار PDPL با تأیید ترانسفکشن پروتئین هدف، امکان شناسایی بسترهای لیگاز E3 ثبت نشده را فراهم می کند.
ما یک پلتفرم علامت‌گذاری مجاورت مشترک ایجاد کرده‌ایم که به شما امکان می‌دهد POI‌های متقابل مکان و زمان را شناسایی کنید.این پلتفرم مبتنی بر پروتئین حساس به نور miniSOG است که تنها حدود 12 کیلو دالتون، کمتر از نیمی از اندازه آنزیم بالغ APEX2 (27 کیلو دالتون) و یک سوم اندازه TurboID (35 کیلو دالتون) است.اندازه کوچکتر باید طیف وسیعی از کاربردها را برای مطالعه برهم کنش پروتئین های کوچک گسترش دهد.برای افزایش بازده کوانتومی اکسیژن منفرد و گسترش حساسیت این رویکرد، کاوش بیشتر در مورد حساس‌کننده‌های نور اضافی، چه پروتئین‌های کدگذاری شده ژنتیکی یا مولکول‌های کوچک مورد نیاز است.برای نسخه فعلی miniSOG، وضوح زمانی بالا را می توان با استفاده از نور آبی برای فعال کردن نشانگرهای مجاورت به دست آورد.علاوه بر این، زمان قرار گرفتن در معرض طولانی‌تر، «ابر» بزرگ‌تری از اکسیژن منفرد را آزاد کرد که منجر به اصلاح باقی‌مانده‌های دیستال هیستیدین، افزایش شعاع برچسب‌گذاری و توانایی تنظیم دقیق وضوح فضایی PDPL شد.ما همچنین هفت کاوشگر شیمیایی را برای افزایش نسبت سیگنال به پس زمینه آزمایش کردیم و مکانیسم مولکولی پشت این رویکرد را بررسی کردیم.گردش کار TOP-ABPP همراه با جستجوی باز بی‌طرفانه تأیید کرد که تغییرات فقط در هیستیدین‌ها رخ داده است و هیچ ریزمحیط ثابتی برای افزایش تغییرات هیستیدین مشاهده نشد، به جز ترجیح متوسط ​​برای هیستیدین‌ها در ناحیه حلقه.
PDPL همچنین برای مشخص کردن پروتئوم‌های درون سلولی با ویژگی و پوشش پروتئوم حداقل قابل مقایسه با سایر روش‌های کاوشگر شیمیایی مرتبط با برچسب‌گذاری مجاورت و اندامک استفاده شده است.نشانگرهای مجاورت نیز به طور موفقیت آمیزی برای توصیف پروتئوم های سطحی، لیزوزومی و ترشحی مرتبط با ترشحات مورد استفاده قرار گرفته اند46،47.ما معتقدیم که PDPL با این اندامک های درون سلولی سازگار خواهد بود.علاوه بر این، ما PDPL را با شناسایی اهداف اتصال به پروتئین سیتوزولی که پیچیده‌تر از پروتئین‌های متصل به غشاء هستند به دلیل ویژگی‌های دینامیکی و دخالت در فعل و انفعالات زمانی بیشتر به چالش کشیدیم.PDPL روی دو پروتئین، کواکتیواتور رونویسی BRD4 و لیگاز E3 پارکین مرتبط با بیماری اعمال شد.این دو پروتئین نه تنها برای عملکردهای بیولوژیکی اساسی، بلکه به دلیل ارتباط بالینی و پتانسیل درمانی آنها انتخاب شدند.برای این دو POI، شرکای الزام آور شناخته شده و همچنین اهداف ثبت نشده شناسایی شدند.قابل ذکر است، پروتئین SFPQ مرتبط با جداسازی فاز توسط co-IP تأیید شد، که ممکن است مکانیسم جدیدی را نشان دهد که توسط آن BRD4 (ایزوفرم کوتاه) LLPS را تنظیم می‌کند.در عین حال، ما معتقدیم که شناسایی بسترهای پارکین سناریویی است که در آن شناسایی چسب های غیر مستقیم الزامی است.ما دو بستر پارکین ناشناس را شناسایی کردیم و تخریب آنها را در امتداد مسیر پروتئازوم یوبیکوئیتیناسیون تأیید کردیم.اخیراً یک استراتژی به دام انداختن مبتنی بر مکانیسم برای شناسایی سوبستراهای هیدرولاز با به دام انداختن آنها با آنزیم ها توسعه یافته است.اگرچه این یک روش بسیار قدرتمند است، اما برای تجزیه و تحلیل سوبستراهای درگیر در تشکیل کمپلکس های بزرگ مناسب نیست و نیاز به تشکیل پیوندهای کووالانسی بین آنزیم و بستر دارد.ما انتظار داریم که PDPL را بتوان برای مطالعه سایر مجتمع‌های پروتئینی و خانواده‌های آنزیمی، مانند خانواده‌های deubiquitinase و metalloprotease گسترش داد.
شکل جدیدی از miniSOG به نام SOPP3 با بهبود تولید اکسیژن منفرد ساخته شده است.ما miniSOG را با SOPP3 مقایسه کردیم و عملکرد نشانه‌گذاری بهبود یافته را یافتیم، اگرچه نسبت سیگنال به نویز بدون تغییر باقی ماند (شکل تکمیلی 11).ما فرض کردیم که بهینه‌سازی SOPP3 (مثلاً از طریق تکامل هدایت‌شده) منجر به پروتئین‌های حساس‌کننده نور کارآمدتر می‌شود که به زمان نور کوتاه‌تری نیاز دارند و بنابراین اجازه می‌دهند فرآیندهای سلولی پویاتری ثبت شوند.قابل ذکر است که نسخه فعلی PDPL محدود به محیط سلولی است زیرا به نور آبی نیاز دارد و نمی تواند به بافت های عمیق نفوذ کند.این ویژگی مانع استفاده از آن در مطالعات مدل حیوانی می شود.با این حال، ترکیب اپتوژنتیک با PDPL می تواند فرصتی برای تحقیقات حیوانی، به ویژه در مغز فراهم کند.علاوه بر این، سایر حساس کننده های نوری مادون قرمز مهندسی شده نیز این محدودیت را برطرف می کنند.در حال حاضر تحقیقات در این زمینه در حال انجام است.
رده سلولی HEK293T از ATCC (CRL-3216) به دست آمد.آزمایش رده سلولی برای عفونت مایکوپلاسما منفی بود و در DMEM (Thermo, #C11995500BT) همراه با 10٪ سرم جنین گاو (FBS, Vistech, #SE100-B) و 1٪ پنی سیلین/استرپتومایسین (Hyclone, #SV30010) کشت داده شد.رشد کرده در
3-آمینوفنیلن (نمونه 3) و (4-اتینیل فنیل) متانامین (نمونه 4) از بیدیفارم خریداری شد.پروپیلامین (پروب 2) از Energy-chemicals خریداری شد.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (کاوشگر 1) با توجه به روش های منتشر شده سنتز شد.
جدول تکمیلی 1 ساختارهای ژنتیکی مورد استفاده در این مطالعه را فهرست می کند.توالی‌های miniSOG و KillerRed از یک پلاسمید هدیه از P. Zou (دانشگاه پکن) کلون شدند.توالی هدف گیری ماتریکس میتوکندری از 23 اسید آمینه N ترمینال COX4 مشتق شده و با استفاده از مجموعه گیبسون در ناقل های مشخص شده کلون شد (Beyotime, #D7010S).برای هدف قرار دادن غشاء و هسته شبکه آندوپلاسمی، DNA انسانی SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) با PCR از یک کتابخانه cDNA از سلول‌های HEK293T و DNA H2B (اهدا شده توسط D. Lin، آزمایشگاه خلیج شنژن) تقویت شد. و شبیه سازی شد، همانطور که در بالا ذکر شد.مگر اینکه مشخص شود، سایر ژن های پروتئینی که برای ترانسفکشن و ساخت رده های سلولی پایدار استفاده می شوند، PCR از کتابخانه cDNA سلولی HEK293T تکثیر شدند.G3S (GGGS) و G4S (GGGGS) به عنوان پیوند دهنده بین پروتئین طعمه و miniSOG استفاده شد.یک برچسب اپی توپ V5 (GKPIPNPLLGLDST) به این ساختارهای همجوشی اضافه شد.برای بیان در پستانداران و ایجاد یک خط سلولی پایدار، ساختار همجوشی miniSOG در ناقل لنتی ویروسی pLX304 سابکلون شد.برای بیان باکتری، miniSOG در وکتور pET21a با برچسب 6xHis در C-پایانه کلون شد.
سلول‌های HEK293T در 2.0 در 105 سلول در هر چاهک در صفحات شش چاهی کاشته شدند و 24 ساعت بعد با پلاسمیدهای لنتی ویروسی نوترکیب (2.4 میکروگرم pLX304) و پلاسمیدهای بسته‌بندی ویروسی (1.5 میکروگرم psPAG2 و 1.2 میکروگرم psPAG2 و 1.2 میکروگرم با استفاده از pMD0yoBepo2) 24 ساعت بعد ترانسفکت شدند. ، #C0533)، حدود 80٪ همجوشی.پس از ترانسفکشن یک شبه، محیط کشت عوض شد و به مدت 24 ساعت دیگر انکوبه شد.جمع آوری ویروس پس از 24، 48 و 72 ساعت انجام شد.قبل از عفونت رده های سلولی هدف، محیط ویروسی از طریق فیلتر 0.8 میکرومتر (Merck, #millex-GP) فیلتر شد و پلی برن (Solarbio, #H8761) به غلظت 8 میکروگرم بر میلی لیتر اضافه شد.پس از 24 ساعت، سلول ها با تغییر محیط بازیابی شدند.سلول‌ها با استفاده از 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر بلاستی‌سیدین (Solarbio، #3513-03-9) برای سه پاس اول به عنوان یک انتخاب دقیق‌تر انتخاب شدند.سپس از 20 میکروگرم در میلی لیتر به عنوان یک رژیم سختگیرانه تر برای سه پاساژ بعدی استفاده کرد.
سلول ها در اتاقک های 12 چاهی (Ibidi، #81201) با تراکم تقریباً 20000 سلول در هر چاه کاشته شدند.برای بهبود چسبندگی سلول های HEK293T، 50 میکروگرم در میلی لیتر فیبرونکتین (Corning، #356008) رقیق شده در سالین بافر فسفات (PBS، Sangon، #B640435) در دمای 37 درجه سانتی گراد اضافه کنید.محفظه ها به مدت 1 ساعت پیش تیمار شدند و سپس با PBS خارج شدند.پس از 24 ساعت، سلول ها یک بار با PBS شسته شدند، با 1 میلی مولار پروب 3 در محلول نمک متعادل هنکس (HBSS, Gibco, #14025092) به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شدند و سپس با یک LED آبی (460 نانومتر) انکوبه شدند. ).) به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق تحت تابش قرار گرفتند.پس از آن، سلول ها دو بار با PBS شسته و با فرمالدئید 4 درصد در PBS (Sangon, #E672002) به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق تثبیت شدند.فرمالدئید اضافی از سلول های ثابت با سه بار شستشو با PBS حذف شد.سپس سلول ها با 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) در PBS نفوذ پذیر شدند و 3 بار با PBS شسته شدند.سپس محفظه را بردارید و به هر نمونه 25 میکرولیتر از مخلوط واکنش کلیکی حاوی 50 میکرومولار Cy3-azide (Aladdin, #C196720)، 2 میلی مولار CuSO4 (Sangon, #A603008)، 1 میلی مولار BTTAA (Confluore, #BDJ-4) اضافه کنید. و 0.5 mg/ml سدیم آسکوربات (Aladdin, No. S105024) و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.پس از یک واکنش سریع، سلول ها شش بار با PBS حاوی 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) شسته شدند و سپس با 5% BSA (Abcone, #B24726) در PBST به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق مسدود شدند.
برای رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی، سلول ها با آنتی بادی های اولیه با توجه به شرایط نشان داده شده انکوبه شدند: mAb ضد V5 موش (1:500، CST، #80076)، خرگوش anti-Hsp60 mAb (1:1000)، ABclonal، #A0564)، آنتی بادی ضد کلنکسین پلی کلونال خرگوش (1:500، Abcam، #ab22595) یا آنتی بادی مونوکلونال A/C ضد لامین خرگوش (1:500؛ CST، #2032) در دمای 4 درجه سانتیگراد در طول شب.پس از 3 بار شستشو با PBST، سلول ها با آنتی بادی های ثانویه انکوبه شدند: الکسا فلور 488 ضد خرگوش بز (Thermo, #A11034) رقیق شده 1:1000، بز ضد موش الکسا فلور 594 (CST، #8889) رقیق شده 1:10.رقیق سازی در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه رقیق می شود.سلول‌ها سپس 3 بار با PBST شسته شدند و با DAPI (Thermo, #D1306) در PBS به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق رنگ‌آمیزی شدند.پس از 3 بار شستشو با PBS، سلول ها در گلیسرول 50% (Sangon, #A600232) در PBS برای تصویربرداری مهر و موم شدند.تصاویر ایمونوفلورسانس با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال ZEISS LSM 900 Airyscan2 و نرم افزار ZNE 3.5 به دست آمد.
برای تصویربرداری فلورسنت اکسیژن منفرد، قبل از افزودن 100 نانومولار Si-DMA در بافر هنکس HEPES (DOJINDO، #MT05)، سلول ها دو بار با بافر HEPES Hanks شسته شدند.پس از قرار گرفتن در معرض نور، سلول ها در انکوباتور CO2 در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 45 دقیقه انکوبه شدند.سپس سلول ها دو بار با بافر HEPES هنکس شسته شدند و با هوخست در بافر HEPES هنکس به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق رنگ آمیزی شدند و با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال ZEISS LSM 900 مشاهده شدند.، #M36008) در بافر HBSS حاوی کلسیم و منیزیم.پس از قرار گرفتن در معرض نور یا دوکسوروبیسین (MCE, #HY-15142A)، سلول ها در انکوباتور CO2 در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه انکوبه شدند، دو بار با بافر HBSS شسته شدند و با Hoechst در بافر HBSS در دمای اتاق انکوبه شدند.دقایق.دوکسوروبیسین به عنوان یک کنترل پروب مثبت استفاده شد که در آن سلول ها با 20 میکرومولار دوکسوروبیسین در HBSS حاوی 1٪ BSA به مدت 30 دقیقه تیمار شدند.تصاویر ایمونوفلورسانس با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال زایس LSM 900 به دست آمد.
سلول های HEK293T که به طور پایدار mito-miniSOG را بیان می کنند با تراکم تقریباً 30 درصد در ظروف 15 سانتی متری کاشته شدند.پس از 48 ساعت، زمانی که 80% تلاقی حاصل شد، سلول ها یک بار با PBS شسته شدند، با 1 میلی مولار پروب 3 در بافر HBSS تازه به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شدند و سپس با LED آبی به مدت 10 دقیقه در اتاق روشن شدند. درجه حرارت..پس از آن، سلول‌ها دو بار با PBS شسته شدند، خراش داده شدند و در بافر PBS سرد حاوی مهارکننده‌های پروتئاز بدون EDTA (MCE، #HY-K0011) معلق شدند.سلول‌ها با سونیکیشن نوک به مدت 1 دقیقه (1 ثانیه روشن و 1 ثانیه خاموش در دامنه 35 درصد) لیز شدند.مخلوط به دست آمده در 15871 xg به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد تا باقیمانده ها حذف شوند و غلظت مایع رویی با استفاده از کیت سنجش پروتئین BCA (Beyotime, #P0009) به 4 میلی گرم در میلی لیتر تنظیم شد.1 میلی‌لیتر از لیزات فوق را با 0.1 میلی‌مولار بیوتین آزید قابل تجزیه نوری (Confluore، #BBBD-14)، 1 میلی‌مولار TCEP (Sangon، #A600974)، لیگاند TBTA 0.1 میلی‌مولار (Aladdin، #T162437)، و 1 میلی‌مولار مکعب SO4 ترکیب کنید. چرخش به مدت 1 ساعت در دمای اتاق.پس از واکنش فوری، مخلوط را به محلول از پیش مخلوط شده (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) در یک ویال شیشه ای 10 میلی لیتری اضافه کنید.نمونه ها مخلوط شده و در دمای 4500 گرم به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شدند.محلول های پایین و بالایی دور ریخته شدند، رسوب دو بار با 1 میلی لیتر متانول شسته شد و در 15871×g به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شد.1 میلی لیتر اوره 8 مولار (Aladdin, No. U111902) را در بی کربنات آمونیوم 25 میلی مولار (ABC, Aladdin, No. A110539) اضافه کنید تا رسوب حل شود.نمونه ها با 10 میلی مولار دی تیوتریتول (Sangon، #A100281 در 25 میلی مولار ABC) به مدت 40 دقیقه در دمای 55 درجه سانتی گراد و سپس 15 میلی مولار یدوااستامید تازه (Sangon، #A600539) در دمای اتاق در تاریکی بازسازی شدند.آلکیلاسیون در 30 دقیقه.5 میلی مولار دی تیوتریتول اضافی برای توقف واکنش اضافه شد.تقریباً 100 میکرولیتر دانه‌های آگارز نوترآویدین (Thermo, #29202) برای هر نمونه با 3 بار شستشو با 1 میلی‌لیتر PBS آماده کنید.محلول پروتئوم فوق با 5 میلی لیتر PBS رقیق شد و با دانه های NeutrAvidin آگارز از قبل شسته شده به مدت 4 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد.سپس دانه‌ها 3 بار با 5 میلی‌لیتر PBS حاوی 2/0 درصد SDS (Sangon, #A600485)، 3 بار با 5 میلی‌لیتر PBS حاوی 1 مولار اوره و 3 بار با 5 میلی‌لیتر ddH2O شسته شدند.دانه‌ها سپس با سانتریفیوژ برداشت و در 200 میکرولیتر 25 میلی‌مولار ABC حاوی 1 مولار اوره، 1 میلی‌مولار CaCl2 (Macklin، #C805228) و 20 نانوگرم در میکرولیتر تریپسین (Promega، #V5280) معلق شدند.تریپسینیزاسیون یک شبه در دمای 37 درجه سانتیگراد با چرخش.واکنش با افزودن اسید فرمیک (Thermo، # A117-50) تا زمانی که pH به 2-3 برسد متوقف شد.دانه ها 3 بار با 1 میلی لیتر PBS حاوی 0.2% SDS، 3 بار با 1 میلی لیتر PBS حاوی 1 مولار اوره و سپس 3 بار با 1 میلی لیتر آب مقطر شسته شدند.پپتیدهای اصلاح شده با لیز نوری (365 نانومتر) به مدت 90 دقیقه با استفاده از 200 میکرولیتر MeOH 70 درصد آزاد شدند.پس از سانتریفیوژ، مایع رویی جمع آوری شد.سپس دانه ها یک بار با 100 میکرولیتر MeOH 70% شسته و مواد رویی ادغام شدند.نمونه ها در غلیظ کننده خلاء Speedvac خشک شده و تا زمان تجزیه در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
برای شناسایی و تعیین کمیت پپتیدهای اصلاح‌شده اکسیژن منفرد، نمونه‌ها در اسید فرمیک 0.1 درصد مجدداً حل شدند و 1 میکروگرم از پپتیدها با استفاده از طیف‌سنج جرمی Orbitrap Fusion Lumos Tribrid مجهز به منبع نانو ESI از Tune و Xcalibur از نرم‌افزار فروشنده 4.3 تجزیه و تحلیل شدند.نمونه ها روی یک ستون مویین 75 میکرومتر × 15 سانتی متر با مواد C18 3 میکرومتری (ReproSil-pur، #r13.b9.) جدا شدند و به یک سیستم EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo) متصل شدند.پپتیدها با کروماتوگرافی گرادیان خطی 95 دقیقه ای از 8٪ حلال B تا 50٪ حلال B (A = 0.1٪ اسید فرمیک در آب، B = 0.1٪ اسید فرمیک در 80٪ استونیتریل) جدا شدند، سپس به صورت خطی به 98٪ B دقیقه افزایش یافتند. در 6 دقیقه با سرعت جریان 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos داده ها را به طور متناوب بین اسکن کامل MS و اسکن MS2 بسته به داده ها جمع آوری می کند.ولتاژ کندوپاش روی 2.1 کیلو ولت تنظیم شد و دمای مویین انتقال یون 320 درجه سانتیگراد بود.طیف MS (350-2000 m/z) با وضوح 120000، AGC 4 × 105 و حداکثر زمان ورودی 150 میلی ثانیه جمع آوری شد.10 متداول‌ترین پیش‌سازهای با بار چندگانه در هر اسکن کامل با استفاده از HCD با انرژی برخورد نرمال 30 درصد، پنجره ایزوله چهار قطبی 1.6 متر برز، و تنظیم وضوح 30000 قطعه قطعه شدند.یک هدف AGC برای طیف سنجی جرمی پشت سر هم با استفاده از 5×104 و حداکثر زمان ورودی 150 میلی ثانیه.استثنا پویا روی 30 ثانیه تنظیم شده است. یون‌های تخصیص‌نخورده یا آن‌هایی که بار 1+ و >7+ داشتند برای MS/MS رد شدند. یون‌های تخصیص‌نخورده یا آن‌هایی که بار 1+ و >7+ داشتند برای MS/MS رد شدند. Неназначенные ионы или ионы со зарядом 1+ و >7+ были отклонены для МС/МС. یون ها یا یون های تخصیص نیافته با بار 1+ و >7+ برای MS/MS رد شدند.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ و >7+ были отклонены для МС/МС. یون ها یا یون های نامشخص با بارهای 1+ و >7+ برای MS/MS رد شدند.
داده های خام با استفاده از پلت فرم محاسباتی FragPipe بر اساس MSFragger پردازش می شوند.بایاس های توده ای و اسیدهای آمینه مربوطه با استفاده از یک الگوریتم جستجوی باز با تحمل جرم پیش ساز از -150 تا 500 دا تعیین شدند.سپس پپتیدهای اصلاح شده با استفاده از تغییرات هیستیدین با افزایش جرمی +229.0964 و +247.1069 Da در PD (Proteome Discoverer 2.5، Thermo) شناسایی شدند.
سلول هایی که به طور پایدار ژن miniSOG ذوب شده را بیان می کنند در ظروف 6 سانتی متری قرار گرفتند.پس از رسیدن به تلاقی 80%، سلول ها یک بار با HBSS شسته شدند (Gibco، #14025092)، سپس با پروب های شیمیایی در HBSS به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شدند و با نور آبی روشن شدند.LED 10W به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق.برای تعیین نوع گونه‌های اکسیژن فعال در PDPL، 0.5 میلی‌مولار ویتامین C (MCE، #HY-B0166)، 5 میلی‌مولار Trolox (MCE، #HY-101445)، D2O (Sigma، #7789-20-0)، 100 میلی‌مولار مانیتول (انرژی شیمیایی، #69-65-8)، 100 میکرومولار H2O2، 10 میلی‌مولار NaN3 به عنوان مکمل به سلول‌ها اضافه شد.پس از شستشو با PBS سرد، سلول‌ها خراش داده شدند، در لوله‌های سانتریفیوژ 1.5 میلی‌لیتری جمع‌آوری شدند و با یک نوک به مدت 1 دقیقه در 200 میکرولیتر PBS با 1x مهارکننده پروتئاز بدون EDTA (1 ثانیه و 1 ثانیه بدون، دامنه 35 درصد) فراصوت شدند.مخلوط به دست آمده در 15871 × گرم به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شد و غلظت مایع رویی با استفاده از کیت سنجش پروتئین BCA به 1 میلی گرم در میلی لیتر تنظیم شد.تقریباً 50 میکرولیتر از لیزات فوق با 0.1 میلی‌مولار رودامین آزید (علاءالدین، شماره T131368)، 1 میلی‌مولار TCEP، لیگاند TBTA 0.1 میلی‌مولار و 1 میلی‌مولار CuSO4 به مدت 1 ساعت در دمای اتاق با چرخش از پایین به بالا انکوبه شد.پس از واکنش کلیک، رسوب با استون با افزودن 250 میکرولیتر استون از پیش سرد شده به نمونه ها، انکوباسیون در 20- درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه و سانتریفیوژ در 6010×g به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد انجام شد.گلوله را جمع آوری کرده و در 50 میکرولیتر از بافر 1 x Laemmli به مدت 10 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد بجوشانید.سپس نمونه ها بر روی ژل های بلند SDS-PAGE آنالیز و با استفاده از سیستم تصویربرداری Bio-rad ChemiDoc MP Touch با نرم افزار Image Lab Touch مشاهده شدند.
بیان و خالص سازی پروتئین miniSOG-6xHis نوترکیب همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد.به طور خلاصه، سلول های E. coli BL21(DE3) (TransGen، #CD701-02) با pET21a-miniSOG-6xHis تبدیل شدند و بیان پروتئین با 0.5 میلی مولار IPTG (Sangon، #A600168) القا شد.پس از لیز سلولی، پروتئین ها با استفاده از دانه های آگارز Ni-NTA (MCE، شماره 70666) خالص شدند، در برابر PBS دیالیز شدند و در دمای 80- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
برای سنجش نزدیکی برچسب در شرایط آزمایشگاهی مبتنی بر آنتی بادی، 100 میکرومولار miniSOG خالص، 1 میلی‌مولار پروب 3، و 1 میکروگرم آنتی‌بادی مونوکلونال ضد برچسب موش (TransGen، #HT501-01) را در PBS تا حجم کل واکنش 50 میکرولیتر مخلوط کنید..مخلوط واکنش با نور LED آبی به مدت 0، 2، 5، 10 و 20 دقیقه در دمای اتاق تحت تابش قرار گرفت.مخلوط با 0.1 میلی مولار بیوتین-PEG3-آزید (Aladdin, #B122225)، 1 میلی‌مولار TCEP، لیگاند TBTA 0.1 میلی‌مولار، و 1 میلی‌مولار CuSO4 به مدت 1 ساعت در دمای اتاق روی یک تکان دهنده حرکتی رو به بالا انکوبه شد.پس از یک واکنش سریع، 4 برابر بافر Laemmli's را مستقیماً به مخلوط اضافه کنید و در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه بجوشانید.نمونه‌ها روی ژل‌های SDS-PAGE آنالیز شدند و با وسترن بلات با استرپتاویدین-HRP آنالیز شدند (1:1000، Solarbio، #SE068).
یک پپتید مصنوعی حاوی هیستیدین با آمیداسیون C ترمینال (LHDALDAK-CONH2) برای تجزیه و تحلیل برچسب‌گذاری آزمایشگاهی مبتنی بر پپتید در نزدیکی استفاده شد.در این روش، miniSOG خالص 100 میکرومولار، پروب 3 10 میلی‌مولار و پپتید مصنوعی 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر در حجم واکنش کل 50 میکرولیتر در PBS مخلوط شدند.مخلوط واکنش با نور LED آبی به مدت 1 ساعت در دمای اتاق تحت تابش قرار گرفت.یک میکرولیتر نمونه با استفاده از سیستم LC-MS (طیف‌سنج جرمی Waters، SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight با نرم‌افزار تحلیل طیف MassLynx) آنالیز شد.
سلول‌های HEK293T که به‌طور پایدار ژن همجوشی miniSOG را بیان می‌کنند در ظروف 10 سانتی‌متری برای خطوط با مکان‌یابی اندامک‌های مختلف (Mito، ER، Nucleus) و ظروف 15 سانتی‌متری برای خطوط Parkin-miniSOG و BRD4-miniSOG کاشته شدند.پس از رسیدن به تلاقی 90٪، سلول ها یک بار با HBSS شسته شدند، سپس با پروب 3 در HBSS به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند و با یک LED آبی 10 W در دمای اتاق روشن شدند.برای برچسب زدن بدون تماس پارکین، حامل پروتون کربونیل سیانید 10 میکرومولار m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) با پروب 3 در HBSS به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد اضافه شد.مراحل لیز سلولی، شیمی کلیک، احیا و آلکیلاسیون همان مراحلی بود که در بالا توضیح داده شد، با این تفاوت که 2 میلی گرم لیزات اضافه شد و در واکنش کلیک به جای بیوتین آزید قابل تجزیه نور، از بیوتین آزید PEG3 استفاده شد.پس از غنی‌سازی، دانه‌ها 3 بار با 5 میلی‌لیتر PBS حاوی 2/0 درصد SDS، 3 بار با 5 میلی‌لیتر PBS حاوی 1 مولار اوره و 3 بار با 5 میلی‌لیتر PBS شسته شدند.پس از آن، 2 میکروگرم تریپسین به 300 میکرولیتر 25 میلی مولار ABC حاوی 1 مولار اوره اضافه شد تا پروتئین یک شبه در دمای 37 درجه سانتی گراد جدا شود.واکنش با افزودن اسید فرمیک تا رسیدن به pH 2-3 متوقف شد.پس از تریپسینیزاسیون بر روی مهره ها، محلول پپتید با استفاده از ستون SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) نمک زدایی شد و در غلیظ کننده خلاء Speedvac خشک شد.پپتیدها در اسید فرمیک 1/0 درصد حل شدند و 500 نانوگرم پپتید با استفاده از طیف‌سنج جرمی Orbitrap Fusion Lumos Tribrid مجهز به منبع نانو ESI که در بالا توضیح داده شد، تجزیه و تحلیل شدند.پپتیدها بر روی پیش ستون های تجاری RP-HPLC (75 میکرومتر در 2 سانتی متر) (ترمو، شماره 164946) و ستون های RP-HPLC تحلیلی (75 میکرومتر در 25 سانتی متر) (ترمو، شماره 164941)، که هر دو با 2 میکرومتر پر شده بودند، جدا شدند.شیب از 8٪ به 35٪ ACN در 60 دقیقه، سپس به صورت خطی به 98٪ B در 6 دقیقه با سرعت جریان 300 Nl/min افزایش یافت.طیف MS (350-1500 m/z) با وضوح 60000، AGC 4 × 105 و حداکثر زمان ورودی 50 میلی ثانیه جمع آوری شد.یون‌های انتخابی به‌طور متوالی توسط HCD در سیکل‌های 3 ثانیه‌ای با انرژی برخورد نرمال‌شده 30 درصد، پنجره جداسازی چهارقطبی m/z 1.6 و وضوح 15000 قطعه قطعه شدند. یک هدف طیف‌سنج جرمی 5×104 پشت سر هم AGC و حداکثر زمان تزریق 22 میلی ثانیه استفاده شد.حذف پویا روی 45 ثانیه تنظیم شده است. یون‌های تخصیص‌نخورده یا آن‌هایی که بار 1+ و >7+ داشتند برای MS/MS رد شدند. یون‌های تخصیص‌نخورده یا آن‌هایی که بار 1+ و >7+ داشتند برای MS/MS رد شدند. Неназначенные ионы или ионы со зарядом 1+ و >7+ были отклонены для МС/МС. یون ها یا یون های تخصیص نیافته با بار 1+ و >7+ برای MS/MS رد شدند.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ و >7+ были отклонены для МС/МС. یون ها یا یون های نامشخص با بارهای 1+ و >7+ برای MS/MS رد شدند.
مراحل آماده‌سازی نمونه تا غنی‌سازی دانه‌های نوترآویدین مانند آنالیز LC-MS/MS بود که در بالا توضیح داده شد.تقریباً 50 میکروگرم لیزات به عنوان ورودی برای کنترل بارگذاری و 2 میلی گرم لیزات برای واکنش های کلیک استفاده شد.پس از غنی‌سازی و شستشو با نوتراویدین، پروتئین‌های متصل شده با افزودن 50 میکرولیتر از بافر Laemmli به دانه‌های رزین آگارز و جوشاندن در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه شسته شدند.ورودی بار کنترل و نمونه‌های غنی‌شده با مهره توسط SDS-PAGE آنالیز شدند و با روش‌های استاندارد وسترن بلات به غشاهای PVDF (Millipore, #ISEQ00010) منتقل شدند.غشاها با 5 درصد شیر بدون چربی (Sangon، #A600669) در TBS حاوی 0.1٪ tween-20 (TBST) مسدود شدند و به‌طور متوالی با آنتی‌بادی‌های اولیه و ثانویه انکوبه شدند.آنتی بادی های اولیه 1:1000 در شیر بدون چربی 5 درصد در TBST رقیق شدند و یک شب در دمای 4 درجه سانتی گراد انکوبه شدند.آنتی بادی های ثانویه به نسبت 1:5000 مورد استفاده قرار گرفتند و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند.غشاها با نورتابی شیمیایی با استفاده از سیستم تصویربرداری Chemidoc MP مشاهده شدند.تمام اسکن های برش نخورده لکه ها و ژل ها در شکل به عنوان داده های خام ارائه شده است.
آنتی بادی های اولیه مورد استفاده در این مطالعه شامل آنتی بادی مونوکلونال ضد SFPQ خرگوش (CST، شماره 71992)، آنتی بادی مونوکلونال ضد FUS خرگوش (CST، شماره 67840)، آنتی بادی پلی کلونال ضد NSUN2 خرگوش (Proteintech، شماره 20854-1-). AP)، آنتی بادی پلی کلونال ضد mSin3A خرگوش (Abcam، #ab3479)، آنتی بادی مونوکلونال ضد برچسب موش (TransGen، #HT201-02)، آنتی بادی مونوکلونال ضد β-اکتین موش (TransGen، #HC201-01)، ضد خرگوش آنتی بادی مونوکلونال CDK2 (ABclonal، #A0094)، آنتی بادی مونوکلونال خرگوش به CTBP1 (ABclonal، #A11600)، آنتی بادی پلی کلونال خرگوش به DUT (ABclonal، #A2901)، آنتی بادی پلی کلونال خرگوش به PSMC4 (ABclonal، #A2505 خرگوش)، آنتی بادی پلی کلونال DNAJB1 (ABclonal، # A5504).این آنتی بادی ها در رقت 1:1000 در شیر بدون چربی 5 درصد در TBST استفاده شدند.آنتی بادی های ثانویه مورد استفاده در این مطالعه شامل IgG ضد خرگوش (TransGen، #HS101-01)، ضد IgG موش (TransGen، #HS201-01) در رقت 1:5000 بود.
برای بررسی بیشتر اینکه آیا BRD4 با SFPQ تعامل دارد، سلول‌های HEK293T پایدار و BRD4-miniSOG که HEK293T را بیش از حد بیان می‌کنند در ظروف 10 سانتی‌متری قرار داده شدند.سلول ها با PBS سرد شسته شدند و در 1 میلی لیتر بافر لیز Pierce IP (Thermo Fisher, #87787) با مهارکننده پروتئاز بدون EDTA به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد لیز شدند.پس از آن، لیزات در لوله های سانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری جمع آوری و در 15871 xg به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند.مایع رویی جمع آوری شد و با 5 میکروگرم آنتی بادی مونوکلونال موش نشاندار شده با anti-V5 (CST، #80076) یک شبه در دمای 4 درجه سانتی گراد انکوبه شد.تقریباً 50 میکرولیتر از دانه‌های مغناطیسی پروتئین A/G (MCE, #HY-K0202) را دو بار با PBS حاوی 0.5% Tween-20 بشویید.سپس لیزات سلولی با دانه های مغناطیسی به مدت 4 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد با چرخش از پایین به بالا انکوبه شدند.سپس دانه ها چهار بار با 1 میلی لیتر بافر PBST شسته و به مدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی گراد جوشانده شدند.نمونه ها بر روی ژل های SDS-PAGE آنالیز و با استفاده از روش های استاندارد وسترن بلات به غشاهای PVDF منتقل شدند.غشاها در شیر بدون چربی 5 درصد در TBST مسدود شدند و به طور متوالی با آنتی بادی های اولیه و ثانویه انکوبه شدند.آنتی بادی اولیه خرگوش آنتی بادی مونوکلونال ضد SFPQ (CST، #71992) با نسبت 1:1000 در شیر بدون چربی 5 درصد در TBST استفاده شد و یک شبه در دمای 4 درجه سانتی گراد انکوبه شد.IgG ضد خرگوش به نسبت 1:5000 استفاده شد و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد.غشاها با نورتابی شیمیایی با استفاده از سیستم تصویربرداری Chemidoc MP مشاهده شدند.
تمام ساختارهای مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل سطح قابل دسترسی حلال (SASA) از بانک داده پروتئین (PDB)52 یا پایگاه داده ساختار پروتئین AlphaFold53 به دست آمد.SASA مطلق برای هر باقی مانده با استفاده از برنامه FreeSASA محاسبه شد.فقط داده های SASA کامل و بدون ابهام برای هیستیدین نشاندار شده و همسایگان آن برای به دست آوردن میانگین SASA برای هر ساختار استفاده شد.دسترسی به حلال نسبی (RSA) برای هر هیستیدین با تقسیم مقدار مطلق SASA بر حداکثر تجربی سطح باقیمانده ممکن در دسترس برای حلال محاسبه شد.اگر میانگین RSA کمتر از 20 درصد بود، تمام هیستیدین ها به عنوان پنهان طبقه بندی شدند.
فایل‌های خام به‌دست‌آمده در حالت DDA با استفاده از Proteome Discoverer (v2.5) یا MSfragger (Fragpipe v15.0) در پایگاه‌داده پروتئین تأیید شده SwissProt مناسب حاوی آلاینده‌های رایج جستجو شدند.پپتیدها به تریپسین کامل با دو محل برش گمشده نیاز داشتند، متیلاسیون کاربامویل به عنوان یک اصلاح ثابت و اکسیداسیون متیونین به عنوان یک اصلاح دینامیکی.تحمل وزن پیش ساز و قطعه به ترتیب روی ppm 10 و 0.02 Da (MS2 Orbitrap) تنظیم شد. آلودگی‌ها حذف شدند و پروتئین‌ها برای به دست آوردن نرخ کشف نادرست <1٪ فیلتر شدند. آلودگی‌ها حذف شدند و پروتئین‌ها برای به دست آوردن نرخ کشف نادرست <1٪ فیلتر شدند. 1%. آلودگی‌ها حذف شدند و پروتئین‌ها فیلتر شدند تا نرخ تشخیص کاذب کمتر از 1٪ ارائه شود.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 1%. آلودگی‌ها حذف شدند و پروتئین‌ها فیلتر شدند تا به نرخ مثبت کاذب <1٪ برسند.برای تجزیه و تحلیل کمی بدون استفاده از برچسب، محتوای پروتئین نرمال شده از سه تکرار بیولوژیکی استفاده شد.تجزیه و تحلیل محلی سازی درون سلولی پروتئین با استفاده از تجزیه و تحلیل ژن هستی شناسی (GO) از DAVID Bioinformatics Resources، MitoCarta 3.0 و پایگاه داده های گردآوری شده و منتشر شده توسط گروه Alice Ting انجام شد.نقشه آتشفشان از Perseus (v1.6.15.0) به دست آمده است. تغییرات برابری فراوانی پروتئین برای اهمیت آماری با استفاده از آزمون t دو طرفه مورد آزمایش قرار گرفت و بازدیدهای پروتئین با تغییر فراوانی > 2 (مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد) و مقدار p <0.05 شناسایی شدند. تغییرات برابری فراوانی پروتئین برای اهمیت آماری با استفاده از آزمون t دو طرفه مورد آزمایش قرار گرفت و بازدیدهای پروتئین با تغییر فراوانی > 2 (مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد) و مقدار p <0.05 شناسایی شدند. اصلاح بادرژانیя белка были проверены на статистическую значимость со использованием двустороннего t-критерия، и совпадения белков были идентифицированы сменением содержания> 2 (если не 5.0. تغییرات برابری محتوای پروتئین برای معنی‌داری آماری با استفاده از آزمون t دو دنباله مورد آزمایش قرار گرفت و تطابق‌های پروتئین با تغییر محتوای > 2 (مگر اینکه در غیر این صورت ذکر شده باشد) و مقدار ap <0.05 شناسایی شدند.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 ， ， 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有） 和 和 p 值 <0.05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明 和 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли со использованием двустороннего t-criteriya، а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иноей <0, и значи. اهمیت آماری تغییرات برابری در محتوای پروتئین با استفاده از آزمون t دو دنباله مورد آزمایش قرار گرفت و تطابق پروتئین برای تغییرات محتوایی > 2 (مگر اینکه خلاف آن مشخص شده باشد) و مقادیر p<0.05 تعیین شد.تجزیه و تحلیل برهمکنش پروتئین با استفاده از آنالیز GO همراه با پایگاه داده String انجام شد.
سه تکرار بیولوژیکی با نتایج مشابه انجام شد.تجزیه و تحلیل آماری با GraphPad Prism (نرم افزار GraphPad) و نمودارهای آتشفشانی با Perseus (v1.6.15.0) ایجاد شد.برای مقایسه دو گروه، مقادیر p با استفاده از آزمون t-test Student دو طرفه تعیین شد.فقط پروتئین‌های تک‌تنه‌ای که حداقل دو بار در گروه آزمایش شناسایی شده‌اند، در نمودارهای آتشفشانی گنجانده شدند و مقادیر گمشده مربوطه در گروه کنترل با Perseus از توزیع نرمال جایگزین شدند تا بتوان مقدار p را محاسبه کرد.نوارهای خطا نشان دهنده میانگین ± انحراف استاندارد است.در آنالیزهای پروتئومی برای تجزیه و تحلیل آماری، فراوانی پروتئین‌هایی که در حداقل دو تکرار بیولوژیکی ظاهر می‌شدند حفظ شد.از روش های آماری برای پیش تعیین حجم نمونه استفاده نشد.آزمایشات تصادفی نیستند.محققان در طول آزمایش و ارزیابی نتایج، نسبت به انجام وظایف کور نبودند.
برای کسب اطلاعات بیشتر در مورد طراحی مطالعه، چکیده گزارش تحقیقات طبیعت را که به این مقاله پیوند داده شده است، ببینید.
داده های طیف سنجی جرمی به دست آمده در این مطالعه از طریق مخزن شریک iProX57 تحت شناسه مجموعه داده PXD034811 (مجموعه داده PDPL-MS) به کنسرسیوم ProteomeXchange ارسال شد.داده های خام در قالب فایل های داده خام ارائه می شوند.این مقاله داده های اصلی را ارائه می دهد.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. آشنایی با همسایگی: استفاده از بیوتینیلاسیون وابسته به مجاورت برای مشخص کردن کمپلکس‌های پروتئینی و نقشه‌برداری از اندامک‌ها. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. آشنایی با همسایگی: استفاده از بیوتینیلاسیون وابسته به مجاورت برای مشخص کردن کمپلکس‌های پروتئینی و نقشه‌برداری از اندامک‌ها.Gingras, AS, Abe, KT and Raut, B. آشنایی با محیط اطراف: استفاده از بیوتینیلاسیون وابسته به مجاورت برای مشخص کردن کمپلکس های پروتئینی و نقشه اندامک ها. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物解复合物解并 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. درک محله: از وابستگی محله به زندگی بیولوژیکی استفاده کنید.Gingras, AS, Abe, KT and Raut, B. درک مجاورت: توصیف کمپلکس های پروتئینی و نقشه برداری اندامک ها با استفاده از بیوتینیلاسیون وابسته به مجاورت.جاری.نظر من.شیمیایی.زیست شناسی 48، 44-54 (2019).
گری، جی بی و همکاران.نقشه برداری از ریزمحیط با انتقال انرژی دکستر به سلول های ایمنی.Science 367، 1091-1097 (2020).
هرتلینگ، EL و همکاران.شبکه‌های مقیاس دو پروتئومی، بازسازی سلولی خاص تعامل انسان را تشخیص می‌دهند.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).