اخبار

از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.نسخه مرورگری که استفاده می کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد.برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت ارائه می کنیم.
سلول های سرطانی مکانیسم های مختلفی را برای غلبه بر استرس سلولی و ادامه پیشرفت تکامل داده اند.پروتئین کیناز R (PKR) و فعال کننده پروتئین آن (PACT) پاسخ‌دهنده‌های اولیه هستند که سیگنال‌های استرس مختلف را که منجر به مهار تکثیر سلولی و آپوپتوز می‌شود، نظارت می‌کنند.با این حال، تنظیم مسیر PACT-PKR در سلول های سرطانی تا حد زیادی ناشناخته باقی مانده است.در اینجا، ما دریافتیم که RNA طولانی غیر کد کننده (lncRNA) aspartyl tRNA سنتتاز RNA آنتی سنس 1 (DARS-AS1) مستقیماً در مهار مسیر PACT-PKR نقش دارد و تکثیر سلول های سرطانی را ترویج می کند.با استفاده از غربالگری عملکردی در مقیاس بزرگ lncRNA مرتبط با سرطان CRISPRi 971، متوجه شدیم که DARS-AS1 با افزایش قابل توجهی تکثیر سلول های سرطانی مرتبط است.بنابراین، ناک اوت DARS-AS1 از تکثیر سلولی جلوگیری می کند و آپوپتوز سلول های سرطانی را در رده های سلولی سرطانی مختلف در شرایط آزمایشگاهی ارتقا می دهد و به طور قابل توجهی رشد تومور را در داخل بدن کاهش می دهد.از نظر مکانیکی، DARS-AS1 مستقیماً به حوزه فعال سازی PACT متصل می شود و از تعامل PACT-PKR جلوگیری می کند، در نتیجه باعث کاهش فعال شدن PKR، فسفوریلاسیون eIF2α و مهار مرگ سلولی آپوپتوز می شود.از نظر بالینی، DARS-AS1 به طور گسترده در سرطان های متعدد بیان می شود، و بیان بیش از حد این lncRNA نشان دهنده پیش آگهی ضعیف است.این مطالعه تنظیم خاص سرطان مسیر PACT-PKR را توسط DARS-AS1 lncRNA روشن می کند و هدف دیگری را برای پیش آگهی و درمان سرطان ارائه می دهد.
توانایی سازگاری با استرس یکی از ویژگی های مهم بقا و تکثیر سلول های سرطانی است.تکثیر سریع و علائم متابولیکی سرطان در ریزمحیط‌های خشن - محرومیت از مواد مغذی، هیپوکسی و pH پایین - که می‌تواند مسیرهای پیام‌رسانی مرگ سلولی را تحریک کند به اوج خود می‌رسد.اختلال در تنظیم ژن های حساس به استرس مانند p535، پروتئین های شوک حرارتی 6، 7، KRAS8، 9، و HIF-110، 11، 12، 13 اغلب در سرطان مشاهده می شود، در نتیجه آپوپتوز را مسدود می کند و بقا را افزایش می دهد.
پروتئین کیناز R (PKR) یک حسگر استرس مهم و زیرواحد کیناز فاکتور شروع یوکاریوتی 2α (eIF2α)، یک تنظیم کننده ترجمه است که استرس سلولی را به مرگ سلولی مرتبط می کند.PKR در ابتدا به عنوان یک پروتئین ضد ویروسی با تشخیص یک RNA دو رشته ای خارجی (dsRNA) شناسایی شد.پس از فعال‌سازی، PKR eIF2α را فسفریله می‌کند تا سنتز پروتئین‌های ویروسی و سلولی را مهار کند14،15،16.PACT (پروتئین فعال کننده PKR) به عنوان اولین پروتئین فعال کننده PKR در غیاب dsRNA17،18،19،20،21،22،23 شناسایی شده است.از طریق تعامل مستقیم با PKR، PACT تنش های مختلف (گرسنگی سرم، درمان پراکسید یا آرسنیت) را به PKR و مسیرهای سیگنالینگ پایین دست منتقل می کند.علاوه بر فسفوریلاسیون eIF2α، فعال‌سازی PKR با واسطه PACT، رویدادهای مختلف مرتبط با پاسخ استرس را تحریک می‌کند، از جمله تغییر وضعیت ردوکس از طریق مسیر PI3K/Akt24، افزایش بررسی آسیب DNA از طریق p5325،26 و NF-κB27،28، رونویسی را تنظیم می‌کند، 29. با توجه به نقش حیاتی آنها در پاسخ به استرس، تکثیر، آپوپتوز و سایر فرآیندهای سلولی کلیدی، PKR و PACT اهداف درمانی امیدوارکننده ای برای بسیاری از بیماری ها، به ویژه سرطان 30،31،32،33 هستند.با این حال، با وجود این اهمیت عملکردی و بیولوژیکی پلیوتروپیک، تنظیم فعالیت PACT/PKR در سلول های سرطانی گریزان باقی مانده است.
lncRNA ها رونوشت هایی بزرگتر از 200 نوکلئوتید بدون پتانسیل کدگذاری پروتئین هستند.از آنجایی که پروژه های پیشرفته توالی یابی کل ژنوم هزاران lncRNA را شناسایی کرده اند، 35،36 تلاش زیادی برای روشن شدن عملکرد بیولوژیکی آنها انجام شده است.تعداد فزاینده‌ای از تحقیقات نشان داده‌اند که lncRNAها در بسیاری از فرآیندهای بیولوژیکی از جمله تنظیم غیرفعال‌سازی کروموزوم X38،39، چاپ40، رونویسی41،42، ترجمه43 و حتی رشد سرطان44،45،46،47 نقش دارند.این مطالعات گزارش کردند که بسیاری از lncRNA ها در مسیر PACT/PKR دخیل هستند.یکی از این مطالعات نشان داد که lncRNA ASPACT رونویسی PACT را مهار می کند و حفظ هسته ای mRNA PACT را افزایش می دهد.مطالعات دیگر نشان داده اند که lncRNA nc886 به PKR متصل می شود و فسفوریلاسیون آن را مهار می کند49،50.تا کنون، lncRNA تنظیم کننده فعال سازی PKR با واسطه PACT گزارش نشده است.
Aspartyl-tRNA سنتتاز RNA آنتی سنس 1 (DARS-AS1) به عنوان یک lncRNA انکوژنیک 51،52،53،54 شناسایی شده است.از طریق تنظیم miP-194-5p53، miP-12952 و miP-532-3p51، نشان داده شده است که DARS-AS1 به ترتیب باعث رشد کارسینوم سلول کلیوی سلول شفاف، کارسینوم تیروئید و کارسینوم ریه سلول غیر کوچک می شود.تانگ و همکارانش همچنین دریافتند که DARS-AS1 با حفظ پایداری موتیف اتصال به RNA پروتئین 39 (RBM39) باعث پیشرفت میلوما می شود.با این حال، هیچ مطالعه ای در مورد اینکه آیا این lncRNA در تنظیم فعال سازی PACT-PKR و پاسخ استرس سلول های سرطانی دخیل است یا خیر، انجام نشده است.
در اینجا، ما با استفاده از سیستم CRISPRi یک صفحه نمایش با از دست دادن عملکرد در مقیاس بزرگ انجام دادیم و مشخص کردیم که DARS-AS1 lncRNA باعث تکثیر چندین نوع سلول سرطانی می شود.علاوه بر این، ما یک مکانیسم اصلی را شناسایی کرده‌ایم: DARS-AS1 مستقیماً به PACT متصل می‌شود، اتصال PACT و PKR را مهار می‌کند، از فسفوریلاسیون eIF2α، یک بستر PKR پایین‌تر، جلوگیری می‌کند و در نهایت مرگ سلولی آپوپتوز را مهار می‌کند.در نتیجه، کار ما DARS-AS1 lncRNA را به عنوان تنظیم کننده مسیر PACT-PKR و یک هدف بالقوه برای درمان و پیش آگهی سرطان نشان می دهد.
مطالعات گسترده پروفایل ژنومی صدها lncRNA مرتبط با سرطان را شناسایی کرده است.با این حال، عملکرد آنها تا حد زیادی ناشناخته باقی مانده است56.برای شناسایی نامزدهای امیدوارکننده lncRNA درگیر در پیشرفت سرطان، ما یک غربالگری با از دست دادن عملکرد را برای کاهش تکثیر در رده سلولی سرطان کولورکتال SW620 با استفاده از سیستم CRISPRi انجام دادیم (شکل 1a).ویژگی منحصر به فرد رده های سلولی سرطان کولون SW480 و SW620 این است که آنها از تومورهای اولیه و ثانویه در یک بیمار منفرد گرفته می شوند.این یک مقایسه ارزشمند برای مطالعه تغییرات ژنتیکی در پیشرفت سرطان پیشرفته روده بزرگ فراهم می کند.بنابراین، رونوشت‌های رده‌های سلولی سرطان کولورکتال (SW480 و SW620) را با استفاده از توالی‌یابی RNA تجزیه و تحلیل کردیم و برخی از lncRNA‌های کاربردی بالقوه را از مقالات منتشر شده جمع‌آوری کردیم.بر اساس این نتایج، ما یک کتابخانه sgRNA ترکیبی حاوی 7355 الیگو sgRNA با هدف قرار دادن 971 lncRNA مرتبط با سرطان و 500 الیگو sgRNA هدفمند برای کنترل منفی طراحی کردیم (داده های تکمیلی 1).
نمایش شماتیک غربالگری با استفاده از سیستم CRISPRi.غنی سازی b sgRNA پس از غربالگری.خط نقطه چین افقی نشان دهنده log2 (تغییر برابر) = 0.58 ± است.خط نقطه چین عمودی مقدار p = 0.05 را نشان می دهد.نقاط سیاه نشان دهنده sgRNA غیرهدف (تعیین شده به عنوان NC) هستند.نقاط قرمز sgRNA هایی هستند که DARS-AS1 را هدف قرار می دهند.نقاط آبی sgRNA هایی هستند که LINC00205 را هدف قرار می دهند، یک lncRNA انکوژن که قبلا توضیح داده شده بود.تغییر برابر = (خواندن عادی، روز 17)/(خواندن عادی، روز 0).c نابودی sgRNA DARS-AS1 رشد سلول را مهار کرد.نوارهای خطا نشان دهنده ± انحراف استاندارد سه آزمایش است.* p ≤ 0.05، ** p ≤ 0.01 آزمون t دو دنباله دانشجویی.بیان DARS-AS1 در تومورها (مجموعه داده TCGA).em بیان DARS-AS1 در نمونه های طبیعی و تومور زوجی از بیماران مبتلا به BLCA، KIRC، PRAD، LUSC، UCEC، LUAD، LIHC، KIRP و COAD به ترتیب (داده داده TCGA).مقادیر p با استفاده از آزمون t زوجی دو دنباله دانشجویی به دست آمد.
پس از ساخت پلاسمید و بسته بندی لنتی ویروس، ما رده سلولی سرطان کولورکتال dCas9-SW620 را با کتابخانه فوق در چهار آزمایش عفونت مستقل انتقال دادیم.تعدد عفونت (MOI) برای این عفونت ها 0.1-0.3 بود، که نشان می دهد هر سلول فقط با یک sgRNA قابل انتقال است.پس از 18 روز کشت آزمایشگاهی، پروفایل غنی سازی sgRNA های هدف پس از غربالگری کاهش یا افزایش یافت، در حالی که تعداد الیگونوکلئوتیدهای کنترل غیرهدف نسبتاً بدون تغییر در مقایسه با نمایه قبل از غربالگری باقی ماند، که نشان می دهد هدف ما دارای یک صفحه نمایش خاص است. کتابخانهبرنج.1b و جدول تکمیلی 1). LINC00205، که قبلا گزارش شده بود برای ترویج سرطان ریه و پیشرفت سرطان کبد 58،59،60، غربالگری شد (log2 (تغییر چین) < 0.58-، مقدار p <0.05)، که قابلیت اطمینان این غربالگری را تایید می کند (شکل 1b). LINC00205، که قبلا گزارش شده بود برای ترویج سرطان ریه و پیشرفت سرطان کبد 58،59،60، غربالگری شد (log2 (تغییر چین) < 0.58-، مقدار p <0.05)، که قابلیت اطمینان این غربالگری را تایید می کند (شکل 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию به دست دادن لغت و دست 58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, 5,58, 0,58, 0,58, 0,58, 0,58, 0,58, 0,00, 0,00, 0,00 MB . 1b). LINC00205 که قبلاً برای ترویج پیشرفت سرطان ریه و سرطان کبد گزارش شده بود 58،59،60، حذف شد (log2 (تغییر برابری) <-0.58، p-value <0.05)، که قوی بودن این غربالگری را تأیید می کند (شکل .1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию دست легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0, . 1b). LINC00205، که قبلاً برای ترویج پیشرفت سرطان ریه و کبد گزارش شده بود58،59،60، حذف شد (log2 (تغییر برابری) <-0.58، p-value <0.05)، که قوی بودن این غربالگری را تأیید می کند (شکل .1b).
در میان تمام lncRNA های آزمایش شده، DARS-AS1 نیز غربالگری شد، با سه الیگونوکلئوتید sgRNA همزاد به طور قابل توجهی پس از 18 روز کشت کاهش یافت، که نشان می دهد که نابودی این lncRNA منجر به کاهش تکثیر سرطان می شود (شکل 1b).این نتیجه بیشتر توسط تجزیه و تحلیل MTS در سلول‌های سرطانی روده بزرگ تأیید شد که نشان می‌دهد سرعت رشد سلول‌های نابودکننده DARS-AS1 در مقایسه با سلول‌های کنترل فقط به نصف کاهش یافته است (شکل 1c) و با گزارش‌های قبلی چندین نوع سرطان دیگر سازگار است.: سرطان کلیه سلولی شفاف، سرطان تیروئید و سرطان ریه سلول غیر کوچک51،52،53،55.با این حال، عملکرد و مکانیسم‌های مولکولی آن در سرطان کولورکتال ناشناخته باقی مانده است.بنابراین، ما این lncRNA را برای مطالعه بیشتر انتخاب کردیم.
برای مطالعه بیان DARS-AS1 در بیماران، ما به طور جامع 10327 نمونه تومور را از پروژه اطلس ژنوم سرطان (TCGA) تجزیه و تحلیل کردیم.نتایج ما نشان می‌دهد که DARS-AS1 به طور گسترده در سلول‌های سالم در انواع تومورها، از جمله آدنوکارسینوم کولون (COAD)، کارسینوم سلول شفاف کلیه (KIRC) و کارسینوم سلول پاپیلاری کلیوی (KIRP) بیان می‌شود و به طور قابل‌توجهی تنظیم می‌شود..تعداد بسیار کمی (شکل 1d و شکل تکمیلی 1a, b). تجزیه و تحلیل نمونه‌های سالم/تومور جفت شده، بیان بیشتری از DARS-AS1 را در تومورهای کارسینوم یوروتلیال مثانه (BLCA)، کارسینوم سلول شفاف کلیه (KIRC)، آدنوکارسینوم پروستات (PRAD)، کارسینوم سلول سنگفرشی ریه (LUSC) تایید کرد. ، کارسینوم اندومتر جسم رحم (UCEC)، آدنوکارسینوم ریه (LUAD)، کارسینوم کبد سلولی (LIHC)، کارسینوم سلول پاپیلاری کلیه (KIRP) و آدنوکارسینوم کولون (COAD) (p value < 0.05) (شکل 1e-m) . تجزیه و تحلیل نمونه‌های سالم/تومور جفت شده، بیان بیشتری از DARS-AS1 را در تومورهای کارسینوم یوروتلیال مثانه (BLCA)، کارسینوم سلول شفاف کلیه (KIRC)، آدنوکارسینوم پروستات (PRAD)، کارسینوم سلول سنگفرشی ریه (LUSC) تایید کرد. ، کارسینوم اندومتر جسم رحم (UCEC)، آدنوکارسینوم ریه (LUAD)، کارسینوم کبد سلولی (LIHC)، کارسینوم سلول پاپیلاری کلیه (KIRP) و آدنوکارسینوم کولون (COAD) (p value < 0.05) (شکل 1e-m) .تجزیه و تحلیل نمونه‌های سالم/تومور جفت شده همچنین بیان بیشتری از DARS-AS1 را در تومورهای سرطان یوروتلیال مثانه (BLCA)، کارسینوم سلول‌های کلیوی و کلیوی (KIRC)، آدنوکارسینوم پروستات (PRAD)، کارسینوم سلول سنگفرشی ریه (LUSC) تایید کرد.کارسینوم ایندومتریک (UCEC)، آدنوکارسینوم legkogo (LUAD)، هپاتوسللولارنایا کارسینوم پچنی (LIHC)، پاپیلرنو-کلاتویه کارسینوما پوکی (KIRP) و ادنوکارسینوم تولستوی، (0.0) م) . کارسینوم آندومتر جسم رحم (UCEC)، آدنوکارسینوم ریه (LUAD)، کارسینوم سلول کبدی (LIHC)، کارسینوم سلول پاپیلاری کلیه (KIRP) و آدنوکارسینوم کولون (COAD) (p value < 0.05) (شکل 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 肾 肾 肾 透明 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 中 中 中 中 中 中 中 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 ot显着 更 高 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （（ucec） ， （（（） ， 肝肝 细胞癌 （（， ， 肾 乳头状 细胞癌 （（（和结肠腺癌 （（coad） （p 值<0.05）(图1e-m) .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌.癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m）.تجزیه و تحلیل نمونه‌های جفت شده سالم/تومور نقش DARS-AS1 را در تومورهای سرطان اوروتلیال مثانه (BLCA)، کارسینوم سلول کلیوی سلول شفاف (KIRC)، آدنوکارسینوم پروستات (PRAD) و کارسینوم سلول سنگفرشی ریه (LUSC) بیشتر حمایت کرد.اکسپرسسیا با کارسینوم تلا ماتیک (UCEC)، آدنوکارسینوم legkogo (LUAD)، هپاتوسللولارنوی کارسینوم (LIHC)، نارسایی قلبی عروقی (KIRP) و ادنوکارسینوم (توله CO، 5) -m). بیان در کارسینوم جسم رحم (UCEC)، آدنوکارسینوم ریه (LUAD)، کارسینوم سلولهای کبدی (LIHC)، کارسینوم سلول پاپیلاری کلیه (KIRP) و آدنوکارسینوم کولون (COAD) (p value <0.05) (شکل 1e-m).در مجموع، این نتایج نشان می دهد که DARS-AS1 به طور گسترده و بسیار در انواع سرطان ها بیان می شود.
از آنجایی که DARS-AS1 و DARS (ژن کد کننده رشته آنتی سنس) پروموتر یکسانی دارند و در کنار یکدیگر قرار دارند، ما shRNA را طراحی کردیم تا به طور خاص DARS-AS1 را از بین ببرد اما نه DARS (شکل تکمیلی 2a,b و جدول تکمیلی 2) .علاوه بر SW620، ما همچنین از سه رده سلولی دیگر که DARS-AS1 را به شدت بیان می‌کردند، برای مطالعه اثربخشی و عملکرد شکست shRNA استفاده کردیم (جدول تکمیلی 3).نتایج ما نشان داد که هر سه shRNA‌های توسعه‌یافته حداقل 80 درصد راندمان نابودی DARS-AS1 را با تأثیر کمی بر مقدار mRNA DARS به دست آوردند (شکل تکمیلی 2c-f).علاوه بر این، ما دریافتیم که شکست DARS-AS1 با این shRNA ها به طور قابل توجهی از رشد سلولی در رده های سلولی سرطان کولورکتال SW620 (49.7٪) و HCT116 (27.7٪)، رده سلولی سرطان پستان MBA-MD-231 (53.4٪) جلوگیری می کند.) و رده سلولی هپاتوم HepG2 (92.7٪ کاهش)، و همچنین توانایی آنها برای تشکیل کره های بدون لنگر (متوسط ​​کاهش ~50.8٪، 44.6٪، 40.7٪ و 75.7٪ در هر رده سلولی) (شکل 2a,b).در SW620، نتایج سنجش تشکیل کلونی بیشتر تایید کرد که DARS-AS1 shRNA به طور قابل توجهی تکثیر سلولی را با کاهش متوسط ​​تقریباً 69.6٪ مهار می کند (شکل 2c).
تأثیر shRNA کنترل و DARS-AS1 shRNA بر تکثیر سلولی (a) و تشکیل کروی (b) در سلول‌های SW620، HCT116، MBA-MD-231 و HepG2.c تأثیر shRNA کنترل و shRNA DARS-AS1 بر تشکیل کلنی در سلول های SW620.تکثیر سلولی (d)، تشکیل کروی (e) و تشکیل کلنی (f) سلول‌های SW620 که DARS-AS1 را بیش از حد بیان می‌کنند.داده های نشان داده شده میانگین ± انحراف معیار سه آزمایش است.* p ≤ 0.05، ** p ≤ 0.01، و *** p ≤ 0.001 توسط آزمون t-test Student.
برای تکمیل مطالعات کاهش عملکرد، سلول های SW620 را ایجاد کردیم که بیش از حد DARS-AS1 را بیان می کنند (شکل تکمیلی 2g).بیان بیش از حد DARS-AS1 به طور قابل توجهی رشد سلولی (1.8 برابر)، تشکیل کروی بدون لنگر (1.4 برابر) و تشکیل کلنی (3.3 برابر) را در سلول های SW620 افزایش داد (شکل 2d-f).ما این نتیجه را با استفاده از خط سلولی دیگر بیانگر DARS-AS1، A549 تأیید کردیم.این افزایش تکثیر سلولی به دلیل بیان بیش از حد DARS-AS1 بیشتر در سلول های A549 مشاهده شد (شکل تکمیلی 2h، i و جدول تکمیلی 3).روی هم رفته، این مطالعات سود و زیان نشان می‌دهند که DARS-AS1 تکثیر سلول‌های سرطانی را در شرایط آزمایشگاهی افزایش می‌دهد.
برای کشف مکانیسم اساسی که توسط DARS-AS1 تکثیر سلولی را تنظیم می‌کند، ما یک تجزیه و تحلیل pull-down RNA برای شناسایی شرکای بالقوه اتصال پروتئین آن انجام دادیم.نتایج RT-qPCR نشان داد که حدود 86.2 درصد DARS-AS1 در سیتوپلاسم سلول های SW620 قرار دارد (شکل تکمیلی 3a).سپس DARS-AS1 یا pseudoRNA بیوتینیله رونویسی شده در شرایط آزمایشگاهی با لیزهای سلولی SW620 و به دنبال آن جداسازی SDS-PAGE انکوبه شد.رنگ آمیزی نقره بعدی نشان داد که یک نوار مجزا (~ 38 کیلو دالتون) به طور قابل توجهی در نمونه های کششی DARS-AS1 غنی شده است اما در نمونه های RNA ساختگی یا مهره ها نه (شکل 3a).این باند به عنوان یک پروتئین فعال کننده PKR (PACT) توسط طیف سنجی جرمی (MS) شناسایی شد و بیشتر توسط ایمونوبلات در رده های سلولی SW620، HCT116 و HepG2 تایید شد (شکل 3a،b).غنی‌سازی DARS و پروتئین‌های PACT مرتبط - PKR و TRBP - نیز با استفاده از تجزیه و تحلیل RNA توسط وسترن بلات (WB) مورد بررسی قرار گرفت.نتایج نشان داد که هیچ تعامل مستقیمی بین DARS-AS1 RNA و این سه پروتئین یافت نشد (شکل تکمیلی 3b).برهمکنش خاص بین DARS-AS1 و PACT بیشتر توسط تجزیه و تحلیل رسوب ایمنی RNA (RIP) تایید شد، که نشان داد DARS-AS1 به طور قابل توجهی در آنتی بادی های ضد PACT غنی شده است اما نه سایر RNA های کنترل (شکل 3c).برای تعیین اینکه آیا DARS-AS1 به طور مستقیم با PACT در غیاب سایر اجزای سلولی تعامل دارد یا خیر، یک سنجش تداخل سنجی لایه زیستی آزمایشگاهی (BLI) با استفاده از PACT خالص انجام شد.DARS-AS1 نشاندار شده با بیوتین یا RNA ساختگی روی حسگرهای زیستی استرپتاویدین (SA) تثبیت شد و سپس در بافر جنبشی حاوی 1 میکرومولار PACT انکوبه شد.قابل توجه است که PACT به شدت به DARS-AS1 (مقدار KD ~ 26.9 نانومتر) متصل است، اما نه به تقلید RNA (شکل 3d).در مجموع، این نتایج یک تعامل مستقیم و میل ترکیبی بالا بین DARS-AS1 و PACT را نشان می دهد.
تجزیه و تحلیل کشش RNA، DARS-AS1 را در تعامل با PACT در سلول های SW620 شناسایی کرد.در بالا، رنگ آمیزی نقره پروتئین های مرتبط.immunoblot های پایین تر با آنتی بادی ضد PACT انجام شد.b تجزیه و تحلیل pull-down RNA در سلول های HCT116 (بالا) و HepG2 (پایین) انجام شد.غنی سازی PACT با بلات تشخیص داده شد.سنجش ایمنی cRNA (RIP) در سلول های SW620 با استفاده از آنتی بادی های نشان داده شده انجام شد.منحنی های اتصال PACT به DARS-AS1 تمام طول یا RNA کنترل با استفاده از تداخل سنجی لایه ای (BLI) به دست آمد.RNA روی حسگر زیستی استرپتاویدین بی حرکت شد.1 میکرومولار PACT برای اندازه گیری ارتباط استفاده شد.سنجش کشش RNA با استفاده از DARS-AS1 تمام قد بیوتینیله یا کوتاه شده (بالا) انجام شد.ایمونوبلات نشان دهنده PACT دریافت شده (پایین).f PACT پرچمدار خالص شده با DARS-AS1 تمام قد بیوتینیله یا کوتاه شده (مانند e) برای سنجش RIP در شرایط آزمایشگاهی انکوبه شد.RNA استخراج شده توسط RT-qPCR تایید شد.g میل نسبی قطعات RNA مختلف برای PACT با استفاده از تداخل سنجی لایه ای به دست آمد.برای تجزیه و تحلیل، 100 نانومولار RNA و 1 میکرومولار RAST استفاده شد.h در شرایط آزمایشگاهی سنجش RIP با استفاده از خالص دست نخورده یا کوتاه برچسب دار انجام شد.RNA استخراج شده توسط RT-qPCR تایید شد.i نرخ رشد سلول های SW620 که DARS-AS1، PACT یا هر دو را بیش از حد بیان می کنند.j بیان بیش از حد DARS-AS1 تمام طول یا کوتاه شده در سلول های SW620 اثرات متفاوتی بر رشد سلول داشت.k آپوپتوز توسط ایمونوبلات با آنتی بادی ضد PARP تشخیص داده شد.حذف DARS-AS1 باعث القای آپوپتوز سلول های SW620 همانطور که توسط فلوسیتومتری نشان داده شده است.داده های نشان داده شده میانگین ± انحراف معیار سه آزمایش است. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p <0.0001، توسط آزمون t دانشجوی دو طرفه. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p <0.0001، توسط آزمون t دانشجوی دو طرفه. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p < 0.0001 توسط آزمون t دانشجوی دو طرفه. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p < 0.0001 توسط آزمون t دانشجوی دو طرفه.
سپس سه قطعه RNA DARS-AS1 بیوتینیله شده را با رونویسی آزمایشگاهی برای شناسایی ناحیه DARS-AS1 مورد نیاز برای ارتباط PACT تولید کردیم (شکل 3e).نتایج آنالیز RNA نشان داد که هر قطعه قادر به برهمکنش با PACT بود، اما ناحیه 3' ترمینال (384-768 نوکلئوتید با برچسب A3) بیش از 1-384 نوکلئوتید با برچسب A1 را نشان داد (شکل 3e).نتایج مشابهی در سنجش RIP in vitro با استفاده از PACT نوترکیب مشاهده شد (شکل 3f).مطابق با این نتایج، آزمایش‌ها برای اتصال قطعات RNA تثبیت‌شده به PACT با استفاده از BLI همچنین نشان داد که PACT تمایل بیشتری به A3 (384-768 nt) دارد (مقدار KD تقریباً 94.6 نانومولار)، در حالی که تقریباً هیچ پیوندی با مناطق دیگر ندارد.(شکل 3d).
ما همچنین مناطق اتصال مرتبط را در PACT بررسی کردیم.PACT شامل سه حوزه عملکردی است که دو تای آن‌ها حوزه‌های اتصال RNA دو رشته‌ای (dsRBD) و دامنه سوم (به نام D3) هستند که به عنوان فعال کننده برهمکنش‌های پروتئینی عمل می‌کنند.برای بررسی ظرفیت اتصال lncRNA هر دامنه، ما سه جهش را مهندسی کردیم که هر یک از سه دامنه را حذف کردند و یک سنجش RIP در شرایط آزمایشگاهی انجام دادند.نتایج ما نشان داد که حذف دامنه سوم (D3) PACT به طور قابل توجهی برهمکنش آن را با DARS-AS1 (در مقایسه با PACT دست نخورده 0.11 برابر) نسبت به دو جهش دیگر (شکل 3h) کاهش داد، نشان داده شد که انتشار از D3 با DARS تعامل داشت.-AC1.روی هم رفته، این نتایج نشان می‌دهد که تعامل بین DARS-AS1 و PACT ممکن است عمدتاً از طریق انتهای 3' DARS-AS1 و دامنه D3 PACT رخ دهد.
ما اشاره کردیم که DARS-AS1 هیچ تأثیری بر بیان PACT و PACT هیچ تأثیری بر DARS-AS1 نداشت (شکل تکمیلی 3c).سپس اثر PACT knockdown بر رشد سلول را بررسی کردیم.برخلاف DARS-AS1، سلول‌های نسبی 1.5 تا 3 برابر سریع‌تر رشد کردند که PACT از بین رفت (شکل تکمیلی 3d).نتایج سنجش تشکیل کلنی نشان داد که سلول ها پس از درمان shRNA با PACT، کلنی های 2-3 برابری تشکیل دادند (شکل تکمیلی 3e).برای آزمایش اینکه آیا DARS-AS1 تکثیر سلولی را از طریق PACT تنظیم می‌کند، سلول‌های SW620 را تولید کردیم که PACT، DARS-AS1 یا هر دو را بیان می‌کنند.بیان بیش از حد PACT مهار قابل توجهی از تکثیر سلولی را نشان داد (شکل 3i).در حالی که بیان بیش از حد DARS-AS1 به خودی خود به طور قابل توجهی تکثیر سلولی را ترویج می کند، تفاوت معنی داری در سرعت رشد سلول هایی که DARS-AS1 و PACT بیش از حد بیان می کنند وجود ندارد.این نتایج نشان می دهد که PACT ممکن است با افزایش تکثیر ناشی از بیان بیش از حد DARS-AS1 مقابله کند.
از آنجایی که نواحی مختلف DARS-AS1 توانایی‌های اتصال PACT متفاوتی دارند، ما تأثیر نسبی آنها را بر تکثیر سلولی با بیان بیش از حد مختلف قطعات DARS-AS1 بررسی کردیم.در مقایسه با دو قطعه دیگر، DARS-AS1 در انتهای 3' (384-768 nt)، منطقه اصلی مرتبط با PACT در DARS-AS1، که دارای بالاترین توانایی برای تحریک تکثیر سلولی بود، بیش از حد بیان شد (شکل 3j).این نتایج نشان دهنده همبستگی مثبت بین ظرفیت اتصال و عملکرد بیولوژیکی DARS-AS1 است.
گزارش شده است که PACT یک پروتئین پرو آپوپتوتیک است.بنابراین، ما اثر DARS-AS1 بر آپوپتوز را بررسی کردیم.همانطور که انتظار می رفت، شکست DARS-AS1 به طور قابل توجهی برش PARP را در سلول های SW620 افزایش داد و نسبت سلول های انکسین V مثبت را در رده های سلولی SW620، HCT116، HepG2 و MBA-MD-231 افزایش داد (شکل 3k).3).3f-h)، نشان می دهد که اثر ضد آپوپتوز DARS-AS1 در سلول های سرطانی برخلاف عملکرد القای آپوپتوز PACT است.روی هم رفته، این نتایج نشان می‌دهد که مکانیسم عملکرد انکوژنیک DARS-AS1 ممکن است از طریق مهار عملکرد PACT باشد.
در مرحله بعد، مفاهیم عملکردی ارتباط DARS-AS1-PACT را بررسی کردیم.گزارش شده است که PACT PKR را از طریق تعامل مستقیم فعال می کند، که متعاقباً فسفوریلاسیون eIF2α را افزایش می دهد و باعث حذف ترجمه و آپوپتوز می شود.اول، ما بررسی کردیم که آیا DARS-AS1 بر محلی سازی سلولی PACT و PKR تأثیر می گذارد یا خیر.میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال نشان داد که PACT و PKR در سلول‌های SW620 با میانگین ضریب همبستگی پیرسون 0.72 بسیار کلوکالیزه شدند.در همین حال، بیان بیش از حد DARS-AS1 به طور قابل توجهی هم محلی سازی PACT و PKR را کاهش داد (میانگین ضریب همبستگی پیرسون 0.61) (شکل 4a).برای بررسی اینکه آیا DARS-AS1 می‌تواند تعامل PACT-PKR را تعدیل کند، ما یک سنجش هم‌ایمنی رسوب‌گذاری (co-IP) با آنتی‌بادی ضد PACT در لیزهای سلولی SW620 انجام دادیم.PKR در سلول‌های کنترل به‌شدت از نظر ضد PACT غنی شد، در حالی که بازیابی PKR به طور قابل‌توجهی در لیزهای سلول‌هایی که DARS-AS1 بیش از حد بیان می‌کردند کاهش یافت (شکل 4b).PACT و PKR نشاندار خالص برای سنجش اتصال پروتئین در شرایط آزمایشگاهی استفاده شد.بر این اساس، آنهایی که DARS-AS1 را ارائه کردند اما RNA کنترلی نداشتند، برهمکنش PACT-PKR سرکوب شده را نشان دادند (شکل 4c).همه نتایج نشان داد که DARS-AS1 ارتباط PACT و PKR را مختل کرد.
محلی سازی مشترک PACT و PKR در سلول های کنترل یا سلول هایی که DARS-AS1 بیش از حد بیان می کنند با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال مشاهده شد.هسته ها با DAPI رنگ آمیزی شدند.نتایج آماری از 16 عکس به دست آمد.b-ایمنی رسوب همزمان (co-IP) با استفاده از آنتی بادی ضد PACT در لیز سلولی سلول های کنترل SW620 یا سلول هایی که DARS-AS1 را بیش از حد بیان می کنند.c نشاندار PACT، PKR خالص و رونویسی در شرایط آزمایشگاهی با DARS-AS1 یا RNA ساختگی برای تجزیه و تحلیل اتصال پروتئین در شرایط آزمایشگاهی انکوبه شدند.آنتی بادی های ضد پرچم برای رسوب ایمنی استفاده شد.d ایمونوبلات با آنتی بادی های مشخص شده در سلول های SW620 و HCT116 ترانسفکت شده با کنترل shRNA یا DARS-AS1-shRNA و به دنبال آن گرسنگی سرم انجام شد.سطح بیان DARS-AS1 حساسیت سلولی به تاپسیگارگین را تغییر داد.سلول های SW620 با DARS-AS1 shRNA، پلاسمید بیان بیش از حد DARS-AS1 یا پلاسمید کنترل ترانسفکت شدند.سلول ها به مدت 48 ساعت با تاپسیگارژین تیمار شدند و زنده ماندن سلول ها با استفاده از معرف MTS تعیین شد.f DARS-AS1 رونویسی شده در شرایط آزمایشگاهی یا RNA ساختگی و PACT خالص شده برای سنجش فعال‌سازی آزمایشگاهی و تشخیص ایمونوبلات استفاده شد.g ایمونوبلات با استفاده از این آنتی‌بادی‌ها بر روی سلول‌های SW620-ctrl (سمت چپ) یا سلول‌هایی که جهش‌یافته PKR را بیان می‌کنند (راست) انجام شد.سپس این سلول ها با کنترل shRNA یا DARS-AS1-shRNA و سپس گرسنگی سرم ترانسفکت شدند.فلوسایتومتری h نشان داد که غیرفعال شدن PKR جهش یافته آپوپتوز ناشی از DARS-AS1 را در سلول های SW620 جبران می کند.immunoblot با آنتی بادی های مشخص شده در سلول های SW620 (چپ) یا HCT116 (راست) انجام شد.سلول های ترانسفکت شده با shRNA کنترل یا DARS-AS1 shRNA فاقد سرم هستند و با مهارکننده 100 نانومولار PKR C16 یا DMSO تکمیل می شوند.نوار مقیاس = 5 میکرومتر.داده های نشان داده شده میانگین ± انحراف معیار سه آزمایش است.* p ≤ 0.05 آزمون t دو طرفه Student.
به طور کلی اعتقاد بر این است که به محض اینکه PACT با PKR17 تعامل کرد، فسفوریلاسیون PKR در Thr451 می تواند القا شود.نتایج ما نشان داد که سطح فسفوریلاسیون PKR به طور قابل توجهی در سلول های نابود کننده DARS-AS1 پس از گرسنگی سرم افزایش یافته است (شکل 4d و شکل تکمیلی 4a).بر این اساس، ما دریافتیم که فسفوریلاسیون eIF2α، بستر اصلی PKR، نیز به طور قابل توجهی توسط DARS-AS1 shRNA افزایش یافت (شکل 4d و شکل تکمیلی 4a).Thapsigargin یک عامل استرس زا ER است که باعث می شود ER Ca2 + را آزاد کند.گزارش شده است که درمان با تاپسیگارژین باعث بیان و فعال‌سازی PACT می‌شود، که بیشتر با PKR تعامل دارد و آن را فعال می‌کند و با افزایش فسفوریلاسیون eIF2α منجر به آپوپتوز می‌شود.در اینجا، ما از thapsigargin به عنوان محرک مسیر PACT/PKR استفاده کردیم تا بررسی کنیم که آیا DARS-AS1 می‌تواند به سلول‌ها برای غلبه بر استرس با مهار مسیر PACT/PKR کمک کند.ما مشاهده کردیم که سطح بیان DARS-AS1 با مقاومت سلولی به تاپسیگارژین همبستگی مثبت دارد.سلول‌های SW620 که بیش از حد DARS-AS1 را بیان می‌کردند، زمانی که با تاپسیگارگین درمان شدند، بهتر زنده ماندند، در حالی که سلول‌های با کاهش DARS-AS1 حساس‌تر شدند (شکل 4e).مطابق با این نتایج، بیان بیش از حد DARS-AS1 فسفوریلاسیون PKR ناشی از تاپسیگارگین را کاهش داد (شکل تکمیلی 4b).در مقابل، پس از تیمار تاپسیگارگین، PKR و eIF2α به میزان بیشتری در سلول‌های نابودکننده DARS-AS1 در مقایسه با سلول‌های کنترل فسفریله شدند (شکل تکمیلی 4b).جالب توجه است، thapsigargin بیان DARS-AS1 را به روشی وابسته به دوز القا می کند، که ممکن است نشان دهنده عملکرد ضد استرس DARS-AS1 باشد (شکل تکمیلی 4c).علاوه بر این، ما سنجش‌های فعال‌سازی آزمایشگاهی را برای تأیید این مشاهدات انجام دادیم.به طور خلاصه، PKR با استفاده از آنتی بادی ضد PKR از لیزهای سلولی خالص شد، سپس با PACT نوترکیب و DARS-AS1 رونویسی شده در شرایط آزمایشگاهی انکوبه شد.پس از واکنش آنزیمی، فسفو-PKR با استفاده از WB شناسایی شد.نتایج ما نشان داد که فسفوریلاسیون PKR به طور قابل توجهی توسط DARS-AS1 مهار شد، اما نه توسط RNA کنترل (شکل 4f).این نتایج in vitro و in vivo نشان می‌دهد که DARS-AS1 فعال‌سازی PKR با واسطه PACT را مهار می‌کند.در همان زمان، ما همچنین کاهش در بازیابی PACT را در حضور DARS-AS1 مشاهده کردیم (شکل 4f).این نتیجه با نتایج سنجش اتصال پروتئین در شرایط آزمایشگاهی (شکل 4c) مطابقت دارد و دوباره عملکرد مسدودکننده DARS-AS1 برای ارتباط PACT-PKR را نشان می‌دهد.
Ser246 و Ser287 در دامنه D3 PACT برای فعال شدن PKR تحت استرس سلولی مورد نیاز هستند.جایگزینی دو باقی مانده سرین به جای آلانین، جهش یافته PACT (mutD) را به وجود آورد که در غیاب تنش، PKR را فعال کرد و جایگزینی آلانین (mutA) پروتکل را معکوس کرد.از آنجایی که ما اهمیت این دامنه را در ارتباط مستقیم با DARS-AS1 نشان داده‌ایم، این دو جهش یافته PACT را برای آزمایش اینکه آیا این باقیمانده‌ها می‌توانند در تعامل با DARS-AS1 نیز دخیل باشند، تولید کردیم.جالب توجه است که هر دو جهش توانایی اتصال به DARS-AS1 را از دست دادند (تصویر تکمیلی 4d)، که نشان می دهد ساختار کامل پروتئین PACT ممکن است برای تعامل موثر با DARS-AS1 مورد نیاز باشد.
علاوه بر این، نتایج ما همچنین نشان می‌دهد که مهار تکثیر سلولی ناشی از DARS-AS1-shRNA را می‌توان تا حدی با بیان بیش از حد یک جهش PACT منفی غالب (PACTmutA) یا یک جهش PKR منفی غالب (PKRmut) بازیابی کرد (شکل تکمیلی 4e. e).بیان بیش از حد جهش‌های PKR منفی غالب، فسفوریلاسیون PKR ناشی از نابودی DARS-AS1 و همچنین فسفوریلاسیون eIF2α در سلول‌های فاقد سرم را کاهش داد (شکل 4g).مهمتر از آن، نسبت سلول های آپوپتوتیک القا شده توسط ناک داون DARS-AS1 نیز در سلول هایی که PKRmut را بیش از حد بیان می کنند کاهش یافت (شکل 4h و شکل تکمیلی 4g).مهار فعالیت PKR کیناز همچنین عملکرد DARS-AS1 را مختل می کند، زیرا نتایج نشان می دهد که از بین رفتن DARS-AS1 به ندرت باعث فسفوریلاسیون PKR و eIF2α می شود زمانی که سلول ها با یک مهارکننده C16 مخصوص PKR درمان می شوند (شکل 4i و شکل تکمیلی 4).).روی هم رفته، نتایج ما نشان می‌دهد که DARS-AS1 با مهار فعال‌سازی PKR با واسطه PACT، حداقل تا حدی تکثیر سلولی را ترویج می‌کند.
برای بررسی بیشتر نقش DARS-AS1 در تومورزایی، آزمایش‌های درون تنی را با استفاده از مدل پیوند زنوگرافت موش انجام دادیم. نتایج نشان می دهد که نابودی DARS-AS1 به طور چشمگیری رشد تومور را در موش کاهش داد (p value < 0.0001) (شکل 5a). نتایج نشان می دهد که نابودی DARS-AS1 به طور چشمگیری رشد تومور را در موش کاهش داد (p value < 0.0001) (شکل 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (معنای p <0,0001) (рис. 5a). نتایج نشان می‌دهد که شکست DARS-AS1 رشد تومور را در موش‌ها به شدت کاهش می‌دهد (p value < 0.0001) (شکل 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）、 DARS-AS1 نشان می دهد که نوکداون DARS-AS1 را کاهش می دهد. نتایج نشان داد که شکست DARS-AS1 به طور قابل توجهی رشد تومور را در موش کاهش داد (p value < 0.0001) (شکل 5a).بنابراین، در گروه DARS-AS1 knockdown، کاهش قابل توجهی در حجم متوسط ​​تومور حدود 72.9٪ و میانگین توده تومور حدود 87.8٪ وجود داشت (شکل 5b-d).این نتایج به شدت نشان می دهد که DARS-AS1 می تواند رشد تومور را در داخل بدن به طور قابل توجهی افزایش دهد.
اثرات حذف DARS-AS1 بر روی انکوژن کولورکتال در موش برهنه.منحنی های رشد (a)، اندازه تومور (b)، وزن (c) و تصاویر تومور (d) نشان داده شده است.نوارهای خطا نشان دهنده ±SEM هستند. n = 10. ****p < 0.0001، توسط آزمون t دانشجوی دو طرفه. n = 10. ****p < 0.0001، توسط آزمون t دانشجوی دو طرفه. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 آزمون t دانشجوی دو طرفه.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验. ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p <0.0001 آزمون t دانشجوی دو طرفه.e Kaplan-Meier ارتباط بین سطوح بیان DARS-AS1 و بقای کلی در بیماران مبتلا به UVM، KICH، KIRP، MESO، GBM و LGG را تجزیه و تحلیل کرد.سطوح بالای بیان DARS-AS1 در بیماران در 50٪ بالا بود.سطح پایین بیان DARS-AS1 در بیماران در 50 درصد پایین بود.مقادیر p با استفاده از آزمون log rank تعیین شد.f مدل پیشنهادی که در آن DARS-AS1 مسیر PACT-PKR و رشد تومور را تنظیم می کند.
برای درک بهتر تأثیر بالینی DARS-AS1، ما ارتباط بین بیان آن و بقای بیمار را بررسی کردیم.با تجزیه و تحلیل مجموعه داده TCGA، ما دریافتیم که بیان بالاتر DARS-AS1 با ملانوم یووئال (UVM)، کروموفوبی کلیوی (KICH)، کارسینوم سلول پاپیلاری کلیه (KIRP)، مزوتلیوما (MESO)، مالتی پلکس مرتبط است.بقای کمتر به طور قابل توجهی با گلیوبلاستوم مورفوز (GBM) و بیماران مبتلا به گلیوم مغزی با درجه پایین (LGG) مرتبط بود (شکل 5e).این نتایج نشان می‌دهد که DARS-AS1 ممکن است نقش مهمی در پیشرفت بالینی تومور داشته باشد و ممکن است یک نشانگر زیستی پیش‌بینی‌کننده بالقوه در سرطان‌های متعدد باشد.
در این مطالعه، با استفاده از غربالگری عملکردی CRISPRi در مقیاس بزرگ، تعیین کردیم که DARS-AS1 lncRNA با تنظیم دو پاسخ دهنده استرس کلیدی، PACT و PKR، بر استرس سلول های سرطانی غلبه می کند.با تعامل مستقیم با PACT، DARS-AS1 فعال سازی PKR با واسطه PACT را مهار کرد، در نتیجه از مرگ سلولی آپوپتوز جلوگیری کرد و تکثیر سلولی را ارتقا داد (شکل 5f).دگرگونی DARS-AS1 در انواع مختلفی از سرطان مشاهده شده است، که نشان می دهد عملکرد آن در ارتقاء بقای سلول های سرطانی در شرایط استرس زا ممکن است به طور گسترده برای انواع مختلف سرطان قابل استفاده باشد.
PACT به عنوان یک پروتئین فعال کننده PKR شناخته شده است و فعال سازی PKR با واسطه PACT با تنظیم رونویسی، ترجمه، آپوپتوز و سایر فرآیندهای مهم سلولی نقش مهمی در پاسخ های استرس ایفا می کند.برای دهه‌ها، تلاش‌هایی برای درک مقررات خاص سرطان آبشار PACT-PKR انجام شده است.در اینجا، مطالعه ما مکانیسم متفاوتی از تنظیم PACT-PKR در سلول‌های سرطانی را از طریق lncRNA سلولی DARS-AS1 نشان داد که مستقیماً به PACT متصل می‌شود، تعامل PACT-PKR را مسدود می‌کند، فعال‌سازی PKR و فسفوریلاسیون eIF2α را مهار می‌کند و در نتیجه آپوپتوز ناشی از استرس را مهار می‌کند و تحریک تکثیر نهایی سرطانسلول ها.این کشف اهداف بالقوه lncRNA برای پیش آگهی و درمان سرطان را روشن می کند.
داده‌های ما نشان داد که شکست DARS-AS1 سلول‌ها را به گرسنگی سرم با افزایش قابل‌توجهی در PKR فسفریله و eIF2α حساس می‌کند.این نتایج نشان می‌دهد که DARS-AS1 با مهار فعالیت PACT/PKR، بقای سلول‌های سرطانی را در شرایط سخت افزایش می‌دهد.چندین RNA غیر کدکننده دیگر مانند ASPACT و nc886 نیز با کاهش mRNA PACT48 یا تنظیم اتوفسفوریلاسیون با اتصال به PKR49,50,64 در محور PACT/PKR درگیر هستند.در میان آنها، DARS-AS1 به عنوان یک اختلال در انجمن PACT-PKR عمل می کند.این مطالعه درک ما را از تنظیم محور PACT/PKR و نقش lncRNA ها در پاسخ های استرس غنی می کند.
PACT شامل سه حوزه مجزا است.هر یک از دو dsRBD اول برای دستیابی به اتصال میل ترکیبی بالا PACT به PKR کافی است، در حالی که دامنه سوم (D3) برای فعال سازی PKR در شرایط in vitro و in vivo مورد نیاز است.مطالعه ما نشان داد که DARS-AS1 ترجیحاً با دامنه D3 تعامل دارد (شکل 3h).با توجه به اندازه بزرگ lncRNA (768 نوکلئوتید)، اتصال DARS-AS1 به D3 می تواند از نظر فیزیکی تعامل بین دامنه PACT dsRBD و PKR را مهار کند و در نتیجه ارتباط PACT و PKR را مسدود کند.جهش‌های نقطه‌ای PACT که Ser246 و Ser287 را در D3 با آلانین یا آسپارتات جایگزین کردند، میل اتصال آن به DARS-AS1 را مختل کردند و به اهمیت ویژگی‌های ساختاری و الکتریکی کلی D3 در ارتباط آنها اشاره کردند.جزئیات بیشتری از این مکانیسم در آینده با استفاده از تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی دقیق تر و تجزیه و تحلیل ساختاری PACT با وضوح بالا مورد نیاز خواهد بود.
مطالعات قبلی گزارش کرده‌اند که DARS-AS1 تکثیر سلولی را از طریق مکانیسم‌های متعددی افزایش می‌دهد51،52،53.در یک مثال، محققان مشاهده کردند که DARS-AS1 با هدف قرار دادن miP-194-5p در سلول‌های سرطانی کلیه، ژن DARS کدکننده پروتئین ضد حس خود را افزایش داد.با این حال، در مطالعه حاضر، حذف DARS-AS1 تأثیر کمی بر رونویسی DARS در انواع مختلف سرطان، از جمله حداقل سرطان‌های کولورکتال، سینه و کبد داشت.از آنجایی که lncRNA ها الگوهای بیان خاص سلول و بافت را نشان می دهند، مکانیسم های عملکردی ممکن است در انواع سرطان حفظ نشوند، که ممکن است به این اختلاف بین مشاهدات ما و ارزیابی های قبلی از سرطان های مختلف کمک کند.مطالعات ویژه ای برای روشن شدن مکانیسم های خاص فرآیندهای فیزیولوژیکی و پاتولوژیک مختلف مورد نیاز است.
تجزیه و تحلیل داده های بالینی نشان داد که بیان DARS-AS1 در تومورها با بقای بیماران سرطانی ارتباط معکوس دارد، که بر اهمیت محور DARS-AS1/PACT/PKR در پیش آگهی سرطان تاکید می کند.در نتیجه، مطالعه ما نشان می‌دهد که DARS-AS1 تنظیم‌کننده محور سیگنال‌دهی PACT/PKR است، تکثیر سلول‌های سرطانی را ترویج می‌کند و آپوپتوز را در طول پاسخ استرس مهار می‌کند، که خط دیگری از تحقیقات را فراهم می‌کند و برای تحقیقات آینده در مورد درمان‌های بالقوه مورد علاقه است. .
رده های سلولی انسانی SW620، A549، MBA-MD-231، HCT116، HepG2 و HEK293T از زیرساخت منابع خط سلول ملی در چین به دست آمدند.تمام سلول ها در محیط DMEM (DMEM، Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA) حاوی 10% FBS (جمینی، بروکلین، NY) و 1% پنی سیلین-استرپتومایسین (Thermo Fisher Scientific) در دمای 37 درجه سانتی گراد، 5% CO2 نگهداری شدند.ماشین جوجه کشی.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR، Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451)، Abcam (ab81303);ضد پرچم Abcam (ab125243);Anti-eIF2α، Abcam (A0764));ضد eIF2α (فسفر S51)، Abcam (ab32157)؛anti-PACT (فسفر S246)، Abgent (AP7744b);ضد β-توبولین، CST (2128);IgG معمولی موش، CST (5415S)؛IgG خرگوش طبیعی، CST (2729S).آنتی بادی ها 1:1000 در PBST برای وسترن بلات و 1:100 برای IP رقیق شدند.
sgRNA ها با استفاده از یک ابزار در دسترس عموم به نام CRISPR-ERA66 توسعه یافتند.ما از پارامترهای ابزار پیش‌فرض برای توسعه sgRNA استفاده کردیم و الگوریتم سایت‌های اتصال sgRNA را در ناحیه 3 کیلوبایت محاسبه کرد.با مرکز TSS.مجموعه‌ای از الیگونوکلئوتیدهای sgRNA در CustomArray، Inc. (Bothewell، WA) سنتز شدند و در پلاسمیدهای pgRNA انسانی کلون شدند (Addgene #44248).در مجموع 12 میکروگرم از پلاسمید pgRNA انسانی ادغام شده، 7.2 میکروگرم psPAX2 (Addgene #12260) و 4.8 میکروگرم pMD2.G (Addgene #12259) با استفاده از ترانسفکت مجدد DNA به 5×106 HEK293T در 10 سانتی‌متر ترانسفکت شدند. سلول ها (CWBIO، پکن، چین) به دنبال دستورالعمل های سازنده.سوپرناتانت های حاوی ویروس 48 و 72 ساعت پس از ترانسفکشن جمع آوری و از طریق فیلتر 0.45 میکرومتر فیلتر شدند.برای غربالگری، سلول های SW620 بیان کننده پروتئین همجوشی dCas9/KRAB با انتقال ویروس به دست آمد.سلول های SW620 اصلاح شده با کتابخانه ویروس در چهار آزمایش عفونت مستقل در MOI 0.1-0.3 آلوده شدند و با 2 میکروگرم بر میلی لیتر پورومایسین (Sigma, St. Louis, MO) به مدت 2 روز نمونه برداری شدند.پس از آن، سلول ها به مدت 18 روز در شرایط آزمایشگاهی با حداقل پوشش کتابخانه ای 500 سلول/sgRNA برای غربالگری کشت داده شدند.
DNA ژنومی مطابق دستورالعمل کیت QIAamp DNA Blood Midi (QIAGEN، دوسلدورف، آلمان؛ 51183) استخراج شد.در مجموع، 100 میکروگرم DNA ژنومی در هر تکرار بیولوژیکی برای ساخت کتابخانه استفاده شد.ناحیه sgRNA با دو دور PCR تقویت شد و به بارکد متصل شد.
محصولات PCR با استفاده از ژل NucleoSpin® و کیت خالص‌سازی PCR (MACHEREY-NAGEL، Düren، آلمان؛ 740609.250) خالص شدند و با استفاده از کیت تشخیص DNA دو رشته‌ای Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific؛ Q32854) اندازه‌گیری شدند.
برای اندازه گیری تکثیر سلولی از روش MTS استفاده شد.سلول ها در صفحات 96 چاهی با تراکم اولیه 2000 سلول در چاه کاشته شدند.تعداد نسبی سلول ها روزانه در زمان مشخص شده در مجموع 6-4 روز اندازه گیری شد.برای هر چاه، 20 میکرولیتر معرف MTS (Promega) با 100 میکرولیتر DMEM رقیق شد، به مدت 4 ساعت با سلول ها در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شد و سپس OD490 اندازه گیری شد.
ظرفیت رشد بدون لنگر با تجزیه و تحلیل شکل گیری کره ها کشف شد.به طور خلاصه، 2000 سلول ترانسفکت شده با shRNA DARS-AS1 یا کنترل shRNA در میکروپلیت های چسبندگی بسیار کم (Corning) با تغییر متوسط ​​هر 4 روز یکبار کشت داده شدند.اسفروئیدها پس از 14 روز شمارش شدند.500 سلول ترانسفکت شده با پلاسمید بیان بیش از حد DARS-AS1 یا یک پلاسمید کنترل برای سنجش افزایش استفاده شد، در غیر این صورت روش بدون تغییر بود.
RNA با استفاده از T7 RNA پلیمراز و بیوتین-16-UTP (Roche 1138908910) مطابق دستورالعمل سیستم های ترکیبی Riboprobe® (Promega P1440) رونویسی شد.پرایمرهای مورد استفاده در اینجا در جدول تکمیلی 4 آمده است.
نواحی PACT یا PKR کدکننده پروتئین در pET15b (Addgene #73619) کلون شدند و به BL21 (DE3) تبدیل شدند.باکتری ها یک شبه در LB عرضه شده با آمپی سیلین انکوبه شدند و سپس 100 برابر با LB تازه رقیق شدند.هنگامی که OD600 محیط به 0.8 رسید، 1 میلی مولار IPTG برای القای بیان پروتئین اضافه شد.پس از انکوباسیون یک شبه با تکان دادن ملایم (250 دور در دقیقه در 20 درجه سانتی گراد)، گلوله سلولی با سانتریفیوژ (4000 دور در دقیقه، 10 دقیقه، 4 درجه سانتی گراد) جمع آوری شد.گلوله سلولی را مجدداً در بافر لیز معلق کنید (50 میلی‌مولار تریس، pH 8.0، 250 میلی‌مولار NaCl، 1 میلی‌مولار PMSF) و به مدت 30 دقیقه روی یخ انکوبه کنید، سپس سونیک کنید (15 دقیقه، 5 ثانیه روشن/خاموش، روی یخ) و سانتریفیوژ کنید (13000) دور در دقیقه).30 دقیقه، 4 درجه سانتی گراد).سپس مایع رویی 3 بار در 4 درجه سانتیگراد روی رزین Ni-NTA (QIAGEN) قرار گرفت، 4 بار با بافر شستشو (50 میلی مولار تریس، pH 8.0، 40 میلی مولار ایمیدازول، 250 میلی مولار نمک طعام) شسته شد و 3 بار با کل شستشو شد. از 10 میلی‌لیتر بافر شوینده (50 میلی‌مولار تریس، pH 8.0، 250 میلی‌مولار NaCl، 300 میلی‌مولار ایمیدازول).پروتئین خالص با استفاده از WB تعیین شد و غلظت با استفاده از کیت سنجش پروتئین Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) تعیین شد.
سنجش RIP همانطور که قبلا توضیح داده شد، با تغییرات انجام شد.به طور خلاصه، 1 برابر بافر RIP (25 میلی‌مولار Tris-HCl، pH 7.5، 100 میلی‌مولار NaCl، 0.5% NP-40، مهارکننده ریبونوکلئاز RNasin (Promega)، PMSF (بیوتکنولوژی Beyotime)، 1 میلی‌مولار DDM، پروتئاز) costatic71 xcyto lyses (روش، 1 میلی‌مولار DTT) و با 13000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ کنید.سپس مایع رویی با دانه های مغناطیسی پروتئین A+G (Millipore) کونژوگه با 5 میکروگرم آنتی بادی ضد PACT (Abeam) یا IgG (CST) انکوبه شد.دانه ها 5 بار با بافر 5 برابر RIP شسته شدند، سپس با پروتئیناز K (NEB) هضم شدند.RNA با Trizol استخراج و با RT-qPCR تعیین شد.پرایمرها در جدول تکمیلی 5 ارائه شده است.
سنجش RIP در شرایط آزمایشگاهی طبق پروتکل سنجش استاندارد RIP اصلاح شده انجام شد.در مجموع 5 pmol از RNA رونویسی شده در شرایط آزمایشگاهی 1 برابر با بافر RIP رقیق شد و با انکوباسیون در دمای 65 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه و سپس سرد شدن آهسته تا دمای اتاق بازپخت شد.در مجموع 5 pmol از پروتئین های PACT برچسب دار دست نخورده یا جهش یافته از E. coli خالص سازی شد.با RNA بازسازی شده به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد جوجه کشی کنید و از روش بالا برای تجزیه و تحلیل RIP برای IP ضد پرچم پیروی کنید.
برای تجزیه و تحلیل گسترش RNA، 1 × 107 سلول با بافر 1xRIP لیز شدند.پس از سانتریفیوژ در 13000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد، مایع رویی با 30 میکرولیتر دانه های مغناطیسی استرپتاویدین (بکمن) به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد پیش تیمار شد.سپس lysate خالص شده با tRNA مخمر عرضه شد و با 40 pmol از RNA تجدید طبیعی یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شد، سپس به مدت 2 ساعت دیگر و 20 میکرولیتر از دانه‌های مغناطیسی استرپتاویدین مسدود شده با BSA اضافه شد.مرحله شستشو شامل 4 بار با بافر RIP 5 برابر و 4 بار با بافر RIP 1 برابر بود.پروتئین های مربوطه با بافر شستشوی بیوتین (25 میلی مولار Tris-HCl، pH 7.5، 12.5 میلی مولار D-بیوتین، PMSF) شسته شدند و روی NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) جدا شدند.پس از رنگ‌آمیزی نقره (بیوتیم بیوتکنولوژی)، باندهای خاصی جدا شده و توسط MS آنالیز شدند.
تجزیه و تحلیل Co-IP برای آزمایش تعامل بین PACT و PKR انجام شد.به طور خلاصه، لیزهای رویی با انکوبه کردن 1×107 سلول لیز شده در بافر 1× RIP و سپس سانتریفیوژ کردن در 13000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد تهیه شدند.لیزها با دانه های مغناطیسی پروتئین A + G بارگذاری شدند، با 5 میکروگرم آنتی بادی ضد PACT کونژوگه شدند و به آرامی در طول شب در دمای 4 درجه سانتی گراد چرخانده شدند.دانه ها 3 بار با بافر 5×RIP، دو بار با بافر 1×RIP شسته و با بافر 1×SDS شسته شدند.پروتئین بازیابی شده توسط ژل SDS-PAGE آنالیز و توسط WB شناسایی شد.
دو pmol از PACT پرچمدار و 1 pmol از PKR از E. coli خالص شد.در بافر 1× RIP رقیق شده و با 10 pmol RNA تجدید طبیعی به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.پس از آن، آن ها با آنتی بادی ضد برچسب کونژوگه با مهره مغناطیسی A+G به مدت دو ساعت دیگر انکوبه شدند.سپس دانه ها چهار بار با بافر RIP 1 شسته و با بافر 1x SDS شسته شدند.PACT و PKR حاصل توسط WB شناسایی شد.